Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Lignocellulosen (Stroh, Holz) sind im Unterschied zu den begrenzten fossilen Rohstoffen Erd\u00f6l und Koh-le aufgrund der Prim\u00e4rproduktion h\u00f6herer Pflanzen in nahezu unersch\u00f6pflicher Menge vorhanden. Das komplexe, widerstandsf\u00e4hige Lignocellulose-Netzwerk ist chemisch nur schwer angreifbar. Um an die \u00f6konomisch interessanten Grundbestandteile zu gelangen, muss das Lignocelluloseger\u00fcst aufgeschlossen werden. Vor dem Hintergrund des Nachhaltigkeitsprinzips muss dies so schonend wie m\u00f6glich erfol-gen. Es erscheint daher vielversprechend, sich des nat\u00fcrlichen Abbaupotentials von Mikroorganismen zu bedienen, die evolution\u00e4r einzelne Bestandteile der Lignocellulose als Kohlenstoff- und Energiequelle nutzen. Die effektivsten dieser Organismen finden sich unter den filament\u00f6sen Pilzen. Asco- und Basidiomyceten verf\u00fcgen \u00fcber eine komplexe, einzigartige Ausstattung an extrazellul\u00e4ren Biokatalysatoren (Sekretom), welche ihnen den enzymatischen Aufschluss lignifizierter Biopolymere erm\u00f6glicht. Der Projektansatz kombiniert die moderne Bioverfahrenstechnik mit der Proteomanalytik und der DNA-Rekombinationstechnik, um den in der Natur ablaufenden Kohlenstoffkreislauf effizient nachzubilden und gezielt f\u00fcr die Verwertung von nachwachsenden Rohstoffen einzusetzen. Neuartig ist die vergleichende Untersuchung und verfahrenstechnische Kombination biochemisch unterschiedlicher extrazellul\u00e4rer Enzymbestecke aus Holz bewohnenden Asco- und Basidiomyceten sowie deren gezielte Nutzung.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Schl\u00fcsselenzyme des Lignocellulose-Aufschlusses werden zun\u00e4chst elektrophoretisch und massen-spektrometrisch identifiziert und die codierenden Gene in geeigneten Wirtsorganismen exprimiert. Dadurch werden Enzymcocktails (enzymatischer Werkzeugkasten) zug\u00e4nglich, welche die Aromatenfraktion des Ligninpolymers einer stofflichen Verwertung zug\u00e4nglich machen soll. Zur strukturellen Identifizierung niedermolekularer Abbauprodukte kommen massenspektrometrische und chromatographische Methoden Verfahren zum Einsatz. Das Upscaling der Enzymproduktion und die Vermarktung der neuartigen Biokatalysatoren werden durch die Projektpartner gew\u00e4hrleistet.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Xylaria polymorpha, ein Ascomycet und Pleurotus sapidus, ein Basidiomycet wurden submers und emers auf Rapsstroh als Kohlenstoffquelle kultiviert. W\u00e4hrend der Kultivierung wurden in beiden Vertretern relevante oxidative und hydrolytische Enzymaktivit\u00e4ten detektiert. Durch die Verwendung von Wildtypkultu-ren (~ 4 – 6 L) und anschlie\u00dfender chromatographischer Reinigung der Enzympr\u00e4parationen ist es den Projektpartner LCB und IHI Zittau gelungen, sekretierte Proteine aus beiden Modellspezies zu isolieren und zur Umsetzung von Modellsubstraten bereit zu stellen.
\nInnerhalb des Projektes ist es erstmals gelungen, eine Esterase aus X. polymorpha zu charakterisieren, die eine Ester spaltende Hydrolase mit Rhamnosidase-\u00e4hnlicher Peptidsequenz aufweist. Dar\u00fcber hinaus besitzt diese Esterase die katalytischen Eigenschaften einer Naringinase (EC 3.2.1.40); auch dies wurde bislang noch nicht beschrieben. Mit einer polyvalenten Peroxidase gelang die Umsetzung von Veratrylalkohol (quantitative Oxidation von 0,6 \u00b5mol Substrat in 48 h) und Coniferylalkkohol (vollst\u00e4ndiger Umsatz nach 6 h).
\nF\u00fcr die heterologe Expression in H. polymorpha oder T. reseei wurden folgende Enzyme ausgew\u00e4hlt und erfolgreich heterolog exprimiert: eine Esterase, eine polyvalente Peroxidase, eine Dyp-Typ Peroxidase und eine Lipase aus P. sapidus. Die Peroxidase Produktion wurde im 30 L Fermenter erfolgreich durch-gef\u00fchrt. Eine Arylalkoholoxidase wurde erfolgreich in E. coli kloniert und heterolog exprimiert.
\nDer synergistische Effekt der katalytischen Aktivit\u00e4ten verschiedener Pilzenzyme aus X. polymorpha oder P. sapidus bei der Fermentation von Lignocellulose wurde durch die quantitative Bestimmung der einzelnen Holzzucker, der Gesamtphenole und des Gewichtsverlust nachgewiesen. Es wurde deutlich, dass die h\u00f6chsten Freisetzungen durch Enzymcocktails bewirkt werden, die entweder aus den Hydrolasen XpoFAE & Cell\/Xyl (z.B. Glucose 5,5 bzw. 2,8 mg g-1), oder zus\u00e4tzlich mit der Laccase von X. polymorpha (z.B. Glucose 5,9 bzw. 3,6 mg g-1) erg\u00e4nzt, bestehen. Durch Optimierung der Inkubationsbedingungen wurden ~30% des eingesetzten Rapsstroh in eine l\u00f6sliche Form \u00fcberf\u00fchrt. Auch ein Up-scaling der Reaktion um den Faktor 15 wurde erfolgreich durchgef\u00fchrt.
\nIn einer \u00d6koeffizienzanalyse schnitt dass das chemisch-thermische Organosolv-Verfahren trotz der 1,5-fach besseren Ligninausbeute des enzymatischen Verfahrens besser ab. Dies wird \u00fcberwiegend durch den h\u00f6heren Ethanolverbrauch des enzymatischen Verfahrens bedingt. Allerdings wurde das enzymatische Verfahren bislang nicht hinsichtlich des Ethanolverbrauchs optimiert. Grunds\u00e4tzlich setzt eine \u00f6kologisch-\u00f6konomische Analyse hierbei die Gleichwertigkeit der Produkte voraus – und greift hiermit vermutlich deutlich zu kurz: Das enzymatische Verfahren hat gegen\u00fcber dem Organosolv-Verfahren einen bedeutenden Vorteil: Sowohl der hierdurch gewonnene Zellstoff, als auch das nach der Ligningewinnung verbleibende Permeat sind frei von die Fermentation beeintr\u00e4chtigenden Salzen (z.B. Sulfaten) und toxischen Stoffen. Dies bedeutet, dass die Nebenprodukte des enzymatischen Pflanzenaufschlusses vollst\u00e4ndig wertsch\u00f6pfend als C-Quelle z. B. zu Bioethanol aus Lignocellulose weiterverarbeitet werden k\u00f6nnen. In Zukunft kann daher ein enzymbasiertes Holzaufschlussverfahren bei der \u00f6koeffizienten, ganzheit-lichen Betrachtung deutlich besser abschneiden als heute.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die Projektergebnisse wurden in mehreren Vortr\u00e4gen auf nationaler und internationaler Ebene pr\u00e4sentiert. Aktuell sind insgesamt 5 wissenschaftliche Publikationen zu den Projektergebnissen in Vorbereitung.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Obwohl die Mechanismen der Holzzersetzung durch lignocellulytische Pilzenzyme seit \u00fcber drei Jahrzehnten intensiv untersucht werden, fehlten bislang systematische Studien zur Analyse des komplexen Sekretoms von Asco- und Basidiomyceten. Mit Abschluss des Projektes stehen nun erstmals umfassende Datens\u00e4tze zu den Sekretomen des Ascomyceten Xylaria polymorpha und des Basidiomyceten Pleurotus sapidus bei Kultur auf dem nachwachsenden Rohstoff Rapsstroh zur Verf\u00fcgung. Wildtypenzyme wurden aus Kulturen beider Organsimen pr\u00e4pariert und erfolgreich zur Umsetzung von Modellsubstraten eingesetzt. Mehrere sekretierte Enzyme aus P. sapidus wurden in heterologe Wirte kloniert und in aktiver Form exprimiert. Nach abschlie\u00dfender bioinformatischer Auswertung der generierten Daten wurden optimierte Enzymcocktails zum Aufschluss von Rapsstroh und Holz eingesetzt und dabei Ligninfraktionen freigesetzt. \u00dcber die von der Deutschen Bundesstiftung Umwelt bewilligten Finanzmittel hinaus haben alle beteiligten Partner das Projekt mit Haushaltsmitteln und der Einbindung von zus\u00e4tzlichem Personal unterst\u00fctzt.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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