Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Chirale Amine und Aminoalkohole haben eine gro\u00dfe Bedeutung in der organisch-chemischen und pharmazeutischen Industrie. Sie finden Verwendung f\u00fcr die Produktion enantiomerenreiner Carbons\u00e4uren durch fraktionierte Kristallisation und als chirale Auxiliare und Liganden in enantioselektiven chemischen Synthesen. Besonders hervorzuheben ist der Bedarf an enantiomerenreinen Aminen als Intermediate f\u00fcr die pharmazeutische Industrie und Agrochemie. Neben der selektiven Kristallisation der Enantiomere (max. 50 % Ausbeute) und chemischen Verfahren, stellt bislang die Lipase-katalysierte Racematspaltung das wichtigste enzymatische Verfahren dar. Allerdings werden hier ebenfalls maximal 50 % Ausbeute erreicht und bei Aminoalkoholen ist zus\u00e4tzlich die Einf\u00fchrung bzw. Entfernung von Schutzgruppen notwendig.
\nPhenylalanin-Ammoniak-Lyasen (PAL) katalysieren die reversible Addition von Ammoniak an Zimts\u00e4ure unter Bildung von optisch reinem L-Phenylalanin. Besonders gut untersucht und rekombinant in E. coli exprimierbar ist das Isoenzym PAL1 aus der Petersilie Petroselinum crispum.
\nDas Ziel des Projekts ist die Ver\u00e4nderung der Substratspezifit\u00e4t und Aktivit\u00e4t der PAL, um diese zur Synthese von chiralen Aminen bzw. Aminoalkoholen, ausgehend von unges\u00e4ttigten Substraten, darzustellen. Dieses soll sowohl durch rationales Proteindesign als auch durch gerichtete Evolution der PAL erreicht werden. Ziel ist die Erzeugung von PAL-Varianten mit hoher Enantioselektivit\u00e4t, Aktivit\u00e4t und der F\u00e4higkeit auch Substrate ohne Carboxylgruppe umzusetzen, um einen effizienten und umweltfreundlichen Zugang zu chiralen Aminen und Aminoalkoholen zu erm\u00f6glichen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFolgende Arbeitsschritte wurden angewendet: Computer Modeling: Autodock4\/Autogrid4, automatisiertes Docking von Substraten ins aktive Zentrum unter Verwendung des lamarckischen genetischen Algorithmus; YASARA: Molekulardynamische Simulationen in einer periodischen Wasserbox unter Verwendung des Amber99-Kraftfelds; VMD: Analyse und Visualisierung der von YASARA generierten Trajektorien; rationales Proteindesign, mechanistische Untersuchungen, molekularbiologische Methoden: positionsgerichtete Mutagenese nach dem QuikChange\u00ae-Protokoll, Generierung von fokussierten Mutantenbibliotheken durch positionsgerichtete S\u00e4ttigungsmutagenese; Mikrobiologische und biochemische Methoden: Mikrotiterplatten-basierte (MTP) photometrische Hochdurchsatzassays, Mutantenbibliotheken in MTP, Hochdurchsatz-Proteinexpression in MTP, Durchmusterung der Mutantenbibliotheken, Selektionsassay auf Minimalmedium, Bestimmung von kinetischen Parametern von Enzymen (Michaelis-Menten-Kinetik), Proteinaufreinigung, Affinit\u00e4tschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Gelfiltration.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Zun\u00e4chst sollte durch fokussierte, gerichtete Evolution der Phenylalanin-Ammoniak-Lyase aus Petroselinum crispum (pcPAL) Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber Phenylalaninol generiert werden. Dazu wurde eine Selektionsmethode auf Minimalmedium ohne N-Quellen etabliert und zwei fokussierte Mutantenbibliotheken mit Mutationen der Aminos\u00e4urepositionen 348, 350 und 354 in der ersten Bibliothek und 487, 488 in der zweiten Bibliothek durchmustert. Auf diese Weise konnte jedoch kein Klon mit Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber Phenylalaninol generiert werden. Daher wurde ebenfalls das Hochdurchsatzscreening der Bibliothek mit photometrischen Assays begonnen. Ebenfalls ohne Erfolg. Molek\u00fcldynamische Simulationen zeigten, dass Phenylalaninol aufgrund der fehlenden Carboxylgruppe nicht im aktiven Zentrum zu stabilisieren war. Daher wurde das Substrat zum Tyrosin-Analogon Tyrosinol gewechselt. Durch rationales Design wurde die Einzelmutante Phe137His vorgeschlagen, was in Simulationen zu einer Stabilisierung des Substrats f\u00fchrte. Dieser Mutante konnte tats\u00e4chlich Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber Tyrosinol nachgewiesen werden. Da \u00e4hnliche oder h\u00f6here Aktivit\u00e4ten in echten Tyrosin-Ammoniak-Lyasen zu erwarten waren, wurde die rsTAL aus Rhodobacter sphaeroides als synthetisches Gen mit optimierter Codon-usage bestellt. Die rsTAL zeigte \u00e4hnliche Aktivit\u00e4ten gegen\u00fcber Tyrosinol wie die pcPAL. Es wurden verschiedene Mutantenbibliotheken sowie rationale Punktmutationen der pcPAL-Phe137His-Mutante und der rsTAL generiert und nach erh\u00f6hter Aktivit\u00e4t durchmustert. Es konnte keine Mutante mit erh\u00f6hter Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber Tyrosinol identifiziert werden. Daher wurde nach alternativen Substraten gesucht. Sowohl Tyrosinamide als auch Tyrosinhydrazid k\u00f6nnen von pcPAL-Phe137His und rsTAL umgesetzt werden. Es wurden Biokatalysen zur Aminierung verschiedener ?,?-unges\u00e4ttigter Substrate durchgef\u00fchrt und analysiert. Para-Nitrozimts\u00e4ure stellte sich als ein besonders geeignetes Substrat heraus. Dar\u00fcber hinaus wurde durch molek\u00fcldynamische Simulationen eine neue Hypothese \u00fcber den Mechanismus der Katalyse entwickelt, basierend auf einer einzigen, den chemischen Mechanismus der Katalyse bestimmenden Aminos\u00e4ure Glu484 (pcPAL).<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurde an Fachvortr\u00e4gen auf der Biocat2008 in Hamburg und auf der Enzyme Engineering Conference in Groningen, Niederlande, mit einem Posterbeitrag teilgenommen.
\nEin Ergebnis des Projekts wurde in einer internationalen Fachzeitschrift mit Peer-Review-Begutachtung publiziert: Bartsch, S., Bornscheuer, U.T.: A single residue influences the reaction mechanism of ammonia lyases and mutases, Angew. Chem. Int. Ed., 2009, 48, 3362-3365.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Projektverlauf konnten die f\u00fcr gerichtete Evolution notwendigen Methoden einschlie\u00dflich des Hochdurchsatzscreenings erfolgreich etabliert werden. In ersten Mutantenbibliotheken konnte keine Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber Phenylalaninol generiert werden. Computermodeling erwies sich als hilfreiche Methode zur Analyse der Substratbindung im aktiven Zentrum des Enzyms. Aufgrund dessen wurde die Verwendung von Tyrosinol als besser geeignetes Substrat in Kombination mit der pcPAL-Mutante Phe137His vorgeschlagen und tats\u00e4chlich geringe Aktivit\u00e4t gemessen. Da \u00e4hnliche oder h\u00f6here Aktivit\u00e4ten in echten Tyrosin-Ammoniak-Lyasen zu erwarten waren, wurde die rsTAL aus Rhodobacter sphaeroides als synthetisches Gen mit optimierter Codon-usage bestellt. Die rsTAL zeigte \u00e4hnliche Aktivit\u00e4ten gegen\u00fcber Tyrosinol wie die pcPAL. Es wurden verschiedene Mutantenbibliotheken sowie rationale Punktmutationen der pcPAL-Phe137His-Mutante und der rsTAL generiert und nach erh\u00f6hter Aktivit\u00e4t durchmustert. Es konnte keine Mutante mit erh\u00f6hter Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber Tyrosinol identifiziert werden. Daher wurde nach alternativen Substraten gesucht. Sowohl Tyrosinamide als auch Tyrosinhydrazid k\u00f6nnen von pcPAL-Phe137His und rsTAL umgesetzt werden. Es wurden Biokatalysen zur Aminierung verschiedener ?,?-unges\u00e4ttigter Substrate durchgef\u00fchrt und analysiert. Para-Nitrozimts\u00e4ure stellte sich als ein besonders geeignetes Substrat heraus.
\nAufgrund von molek\u00fcldynamischen Simulationen wurde eine neuartige Hypothese \u00fcber den bisher umstrittenen Mechanismus entwickelt, basierend auf einer einzigen, den chemischen Mechanismus der Katalyse bestimmenden Aminos\u00e4ure Glu484 (pcPAL), und mit Experimenten best\u00e4tigt.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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