Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel dieses Projekts ist die Ver\u00e4nderung der Substratspezifit\u00e4t von Esterasen gegen\u00fcber chiralen Ver-bindungen (Carbons\u00e4uren, Alkohole) mit der Methode der in vivo Evolution. Hierzu stehen mehrere rekombinante Esterasen im Arbeitskreis zur Verf\u00fcgung (BsubE = Bacillus subtilis Esterase, BsteE = Bacillus stearothermophilus Esterase, BS2 = Esterase aus Bacillus subtilis, SDE = Streptomyces diastatochromogenes Esterase [5, 6] und PLE = Pig Liver Esterase). Der Schwerpunkt soll jedoch auf einer Esterase aus Pseudomonas fluorescens SIKW1 (PFE-I), kloniert in E. coli, liegen.
\nDie gerichtete Evolution von Enzymen ist eine sehr aktuelle Methode, bei der zun\u00e4chst Mutationen – meist durch eine error-prone PCR – in vitro eingef\u00fchrt und die daraus resultierenden Mutantenbibliotheken anschlie\u00dfend mittels Hochdurchsatzscreening auf gew\u00fcnschte Varianten durchmustert werden. Obwohl es eine ganze Reihe eindrucksvoller Beispiele f\u00fcr die erfolgreiche Anwendung dieser Methode gibt, fehlt jedoch der in der Natur erfolgende evolutive Druck (survival of the fittest).
\nZur Einf\u00fchrung eines solchen evolutiven Drucks bietet sich die Verwendung des Mutationsstamms oder die Zugabe von chemischen Mutagenen an. Um die Richtung der Mutationen zu beeinflussen, werden dabei speziell ausgew\u00e4hlte Substrate zu einer Kultivierung im Minimalmedium zugegeben. Zum Beispiel kann die Spaltung des einen Enantiomers eine Kohlenstoffquelle liefern, die des anderen ein Antibiotikum oder ein toxisches Produkt freisetzen (Prinzip: Zuckerbrot und Peitsche). Diese Strategie ist der Kern dieses Projekts.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFolgende Methoden wurden angewendet: Synthese von chiralen 3-Phenylbutters\u00e4ureestern, Chiralanalytik mit HPLC, GC-FID und GC-MS, enzymatische Hydrolyse von chiralen Carbons\u00e4ureestern im analytischen und pr\u00e4parativen Ma\u00dfstab, Derivatisierung von Carbons\u00e4uren zu den korrespondierenden Estern zur chiralen GC-Analyse, Enzymscreening im analytischen Ma\u00dfstab, Zellanalyse mittels Durch-flusszytometer, verschiedene molekularbiologische und proteinbiochemische Methoden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Rahmen dieses Projekts sollte ein in vivo Selektionssystem etabliert und dessen Validierung durchgef\u00fchrt werden. Die neuartige Methode wurde am Beispiel der Selektion von Esterasevarianten mit erh\u00f6hter Enantioselektivit\u00e4t gegen\u00fcber 3-Phenylbutters\u00e4ureester getestet. Geeignete Positiv- und Negativkontrollen in Form von enantioselektiven und nicht-enantioselektiven Esterasevarianten (Pyrobaculum calidifontis Esterase pEST vs. Bacillus subtilis Esterase BS2) konnten identifiziert und in dem bevorzugten E. coli-Stamm (E. coli JM109(DE3)) exprimiert werden. Diese ausgew\u00e4hlten Kontrollen wurden anschlie\u00dfend zur Validierung der Methode eingesetzt.
\nZu Beginn des Projekts wurden strukturell \u00e4hnliche Selektionsmolek\u00fcle ausgew\u00e4hlt, also chirale Molek\u00fcle, die einen Selektionsdruck auf die Bakterien aus\u00fcben. Der sogenannte Positivimpuls ist die Kohlenstoffquelle (C-Quelle) Glycerol, und den sogenannten Negativimpuls stellen bromierte Glycerolderivate dar, die in einem Vorscreening mit verschiedenen halogenierten Glycerolderivaten getestet und wegen ihrer geringen Minimalen Hemm-Konzentration (Minimal Inhibitory Concentration, MIC) von 5-10 mM f\u00fcr E. coli JM109(DE3) ausgew\u00e4hlt wurden. Die Synthese der Selektionssubstrate war erfolgreich und die neuen Substanzen wurden anschlie\u00dfend charakterisiert. Nach Veresterung der (R)-und (S)-Enantiomere von 3-Phenylbutters\u00e4ure an Positiv- und Negativimpuls erhielt man die Selektionsester, bei deren enzymatischer Hydrolyse entweder eine C-Quelle oder ein Toxin freigesetzt wird. Weiterhin wurden die Kultivierungsbedingungen angepasst, um ein w\u00e4ssriges System zu erhalten, in dem die Bakterien in Gegenwart der Selektionssubstrate leben und sich vermehren k\u00f6nnen, was eine Interaktion mit den Zellen erlaubt.
\nAls die Grundlagen f\u00fcr das System etabliert waren, konnte der n\u00e4chste Selektionsschritt mit dem Durchflusszytometer durchgef\u00fchrt werden, die Anwendung der Methode f\u00fcr das Hochdurchsatzscreening, was das finale Ziel des Projekts darstellt.
\nHierbei wurden verschiedene Systeme zur Detektion von Bakterien und der Unterscheidung ihres metabolischen Zustands im Durchflusszytometer erprobt und f\u00fcr die Unterscheidung ihrer verschiedenen physiologischen Zust\u00e4nde hinsichtlich ihrer Effektivit\u00e4t \u00fcberpr\u00fcft. Die Kombination der DNA Farbstoffe Syto9 und Propidiumiodid wurde als am besten geeignet festgestellt. Im Folgenden wurden Positiv- und Negativkontrolle in dem Selektionssystem separat kultiviert und mit dem Durchflusszytometer analysiert. Man konnte dabei beobachten, dass das gew\u00fcnschte unterschiedliche Verhalten mit der Enantioselektivit\u00e4t der jeweils exprimierten Esterase korreliert. Anschlie\u00dfend wurde eine Mischung von Positiv- und Negativkontrolle zusammen in selektivem Medium kultiviert und nach der Analyse mit dem Durchflusszytometer konnten die metabolisch aktivsten Klone sortiert und analysiert werden. Dabei konnte erfreulicherweise eine Anreicherung der Positivkontrolle (pEST) gegen\u00fcber der Negativkontrolle (BS2) festgestellt werden, was den ersten Schritt f\u00fcr die erfolgreiche Validierung der Methode darstellt.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurde an Fachvortr\u00e4gen auf folgenden Tagungen teilgenommen: Biotrans2007 (Oviedo, Spanien), Biocat2008 (Hamburg). Ein Ergebnis des Projekts wurde in einer internationalen Fachzeitschrift mit Peer-Review-Begutachtung publiziert:
\nFernandez-Alvaro, E., Kourist, R., Winter, J., B\u00f6ttcher, D., Liebeton, E., Eck, J., Naumer, C., J\u00e4ger, K.E., Streit, W., Bornscheuer, U.T. (2009): Enantioselective kinetic resolution of phenylalkyl carboxylic acids using metagenome-derived esterases, Microb. Biotechnol., online.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Ein in vivo Selektionssystem zum Auffinden hochselektiver Esterasevarianten gegen\u00fcber 3-Phenylbutters\u00e4ureestern konnte f\u00fcr eine Positiv- (selektive Esterase, pEST) und eine Negativkontrolle (unselektive Esterase, BS2) etabliert und validiert werden. Die Durchmusterung von durch S\u00e4ttigungsmutagenese erstellten Mutantenbibliotheken ergab bislang keine selektiveren Enzymvarianten. Die Anwendung einer in vivo Mutagenese (z. B. durch UV-Licht oder chemischen Mutagenen) und die Kombination mit der Selektionsmethode konnte innerhalb der Projektlaufzeit leider nicht erreicht werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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