Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
In Deutschland fallen im Rahmen der landwirtschaftlichen Produktion, der Holzverarbeitung und der Papierherstellung j\u00e4hrlich tausende Tonnen an Stroh- und Holzabf\u00e4llen an. Diese verholzten Biomaterialien lassen sich allerdings nicht direkt verarbeiten, da die Hauptbestandteile der pflanzlichen Zellwand (Cellu-lose, Hemicellulosen und Lignin) ein komplexes und widerstandsf\u00e4higes, chemisch nur schwer zug\u00e4ngliches Netzwerk bilden. H\u00f6here Pilze besitzen eine in der Natur einzigartige Ausstattung an extrazellul\u00e4ren Enzymen (das Sekretom), welche dieses Netzwerk unter schonenden und umweltkompatiblen Bedingungen aufzuschlie\u00dfen und damit die verschiedenen \u00f6konomisch interessanten Grundbestandteile zug\u00e4nglich zu machen vermag. In einem neuartigen interdisziplin\u00e4ren Projektansatz soll das extrazellul\u00e4re Enzymsystem zweier ausgew\u00e4hlter Pilze qualitativ und quantitativ untersucht werden. Um den in der Natur hocheffizient ablaufenden Kohlenstoffkreislauf abzubilden und gezielt f\u00fcr die biotechnische Verwertung von nachwachsenden Rohstoffen nutzbar zu machen, werden die Instrumentarien der Biologie, der Chemie und der Verfahrenstechnik kombiniert. Durch die Produktion der Schl\u00fcsselenzyme in Pilzzellkulturen wird ein enzymatischer Werkzeugkasten generiert, der f\u00fcr die Bereitstellung von Spezialchemikalien, zur Zellstoffbleichung (Papierherstellung) und zur Produktion von Bioethanol eingesetzt werden kann.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenJeweils ein Vertreter aus der Klasse der Basidio- (Pleurotus sapidus) und der Ascomyceten (Xylaria polymorpha) wurde submers auf Rapsstroh als alleiniger Kohlenstoffquelle kultiviert. Dabei wurden relevante, mit dem Lignocellulose-Abbau in Verbindung zu bringende, enzymatische Aktivit\u00e4ten (u. a. Peroxidase-, Laccase-, Lipase-, Esterase-, Peptidase-, Xylanase- und Glucanase-Aktivit\u00e4t) detektiert und deren Bildung kinetisch verfolgt. Parallel dazu wurden an ausgew\u00e4hlten Kulturtagen die extrazellul\u00e4ren Enzyme \u00fcber Zentrifugation\/Filtration, Ultrafiltration und anschlie\u00dfende Pr\u00e4zipitation aus dem Kultursystem abgetrennt, gereinigt und konzentriert. Die Sekretome beider Pilze wurden mittels hochaufl\u00f6sender zweidimensionaler Gelelektrophorese, kolloidaler Coomassief\u00e4rbung und massenspektrometrischer Detektion (MALDI-TOF, E-SI\/MS-MS) analysiert. Die Reproduzierbarkeit der gesamten analytischen Vorgehensweise wurde durch unabh\u00e4ngige Mehrfachbestimmungen sichergestellt. Basierend auf den Resultaten der Sekretomanalysen wurden die jeweils charakteristischen Schl\u00fcsselenzyme in der zweiten Projekth\u00e4lfte gezielt in Submers-oder Emerskultursystemen produziert und in zellfreien Reaktionsans\u00e4tzen zum en-zymatischen Aufschluss von gemahlenem Rapsstroh eingesetzt (In-vitro-Assay).<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die Arbeiten f\u00fchrten zur Etablierung einheitlicher Kultur- und Aufarbeitungsmethoden, die Voraussetzung f\u00fcr die vergleichende Sekretom-Analyse waren. Die zu unterschiedlichen Klassen geh\u00f6renden Pilze wuchsen in Submers-Kultur mit Rapsstroh als einziger Kohlenstoffquelle. Relevante, am Lignocelluloseabbau beteiligte enzymatische Aktivit\u00e4ten wurden quantifiziert und ihre Bildung kinetisch verfolgt. Interessanterweise nutzten beide Pilzspezies eine von alternierend sekretierten Enzymaktivit\u00e4ten (oxidativ und hydrolytisch) gekennzeichnete Strategie zum Aufschluss des Substrats.
\nAn den Erntetagen mit charakteristischen Enzymaktivit\u00e4ten wurden Proteinpr\u00e4parationen f\u00fcr die hochaufl\u00f6sende 2D-elektrophoretische und massenspektrometrische Analyse hergestellt. Einzelne Proteinspots wurden ausgew\u00e4hlt und massenspektrometrisch (MALDI-TOF-, Nano-LC ESI-MS\/MS-Analysen) anse-quenziert. Anhand von Datenbankrecher-chen sowie auf Grundlage spezifischer Aktivit\u00e4tsmessungen wurden Schl\u00fcsselenzyme des Lignocelluloseabbaus aus beiden Pilzen identifiziert.
\nRelevante Enzyme (Laccasen, Peroxidasen, Polysaccharid-Hydrolasen) beider Pilze wurden in Submers- und Emers-Kulturen produziert. Als Enzym-Rohextrakte wurden diese in zellfreien Reaktionsans\u00e4tzen (in vitro) erfolgreich zur direkten Umsetzung von fein gemahlenem Rapsstroh eingesetzt. Die Vorgehensweise wurde optimiert und die entstandenen Produkte analytisch erfasst (Glucose-Freisetzung, HPSEC und HPLC-DAD). Schlie\u00dflich gelang der Nachweis einer substantiellen enzymatischen Zerlegung von Rapsstroh mit Hilfe eigener sowie kommerzieller Pilzenzyme. Die konzentrierten Enzym-Rohextrakte aus Kultur\u00fcberst\u00e4nden von P. sapidus und X. polymorphasetzten eine aromatisch gepr\u00e4gte, alkalil\u00f6sliche Fraktion im Molekulargewichtsbereich von 0,6 bis 30 kDa aus dem Rapsstroh frei. Das HPSEC-Elutionsprofil der unter Einsatz kommerzieller Enzyme gebildeten alkalil\u00f6slichen Fragmente unterschied sich vor allem im hoch- bis mittelmolekularen Gr\u00f6\u00dfenbereich (>200 – 7 kDa) deutlich von den Fragmentmustern der einzelnen, nicht mit-einander kombinierten Enzympr\u00e4parate. Der gravimetrische Vergleich des nach der Umsetzung zur\u00fcckgebliebenen Rapsstrohs mit einer entsprechenden Kontrolle ohne Enzymbehandlung belegte, dass > 50% der Lignocellulose enzymatisch in eine alkalil\u00f6sliche Form \u00fcberf\u00fchrt wurden. Dies unterstreicht das enorme Potential des gew\u00e4hlten Enzymkombinatorischen Ansatzes. Eine Isolierung, partielle Reinigung und Charakterisierung von drei Hydrolasen (?-Glucosidase, Esterase, Xylanase) und einer Laccase des Ascomyceten X. polymorpha wurde mittels FPLC (Fast Protein Liquid Chroma-tography) durchgef\u00fchrt und verlief bez\u00fcglich der gewonnenen Enzymmengen erfolgreich.
\nTrotz der insgesamt als sehr positiv zu bewertenden Ergebnisse besteht noch ein erheblicher Forschungsbedarf, insbesondere bez\u00fcglich der Optimierung der Enzymproduktion und der Zusammensetzung der Enzym-Cocktails. Im Rahmen des Projektes wurde die prinzipielle Machbarkeit des enzymatischen Aufschlusses von Lignocellulosen am Beispiel von Rapsstroh eindeutig gezeigt und die Ausgangshypothese einer synergistischen und zeitlich regulierten Wirkung von Enzymen best\u00e4tigt. Somit ist der wissenschaftliche Grundstein gelegt, um die gewonnenen Erkenntnisse in zuk\u00fcnftigen Vorhaben f\u00fcr um-weltschonende Verfahren zur stofflichen Biomasseverwertung nutzbar zu machen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
–\tBouws H, Wattenberg A, Zorn H (2008) Fungal Secretomes – Natures toolbox for white biotechnology. Appl Microbiol Biotechnol; DOI 10.1007\/s00253-008-1572-5
\n–\tBouws H, Sch\u00fcttmann I, Szweda R, Zorn H (2008) Sekretome von Basidiomyceten zum enzymatischen Aufschluss von Rapsstroh. Posterpr\u00e4sentation Deutscher Lebensmittelchemikertag
\n–\tHofrichter M (2008) Physiologie und Enzymologie lignozellulytischer Pilze. Kurzvortrag auf dem 3. Treffen der L\u00e4nder\u00fcbergreifenden Zukunftsinitiative Biomassebasierte Stoffproduktion Deutschland Ost (BioMasse Ost). 04.02.2008, FH Lausitz, Senftenberg
\n–\tHofrichter M (2007) Pilze: Geheimnisvolle Wesen aus dem Untergrund mit erstaunlichem biotechnologischen Potential. Herbstsitzung der Th\u00fcringer Akademie f\u00fcr Gemeinn\u00fctzige Wissenschaften, 26.10.2007, Erfurt
\n–\tPecyna M, Liers C, Ullrich R, Hofrichter M (2008) Expression and regulation of laccase genes in the wood-colonizing ascomycete Xylaria polymorpha. Biospektrum, Sonderausgabe, VAAM-Jahrestagung 2008, Frankfurt a. M.
\n–\tZorn H, Sch\u00fcttmann I, Bouws H (2008) Fungal secretomes – versatile toolbox for white biotechnol-ogy. European Bioperspectives (Vortrag angenommen)<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die im Rahmen des Projektes gewonnenen Erkenntnisse sind von grundlegender Bedeutung und richtungweisend f\u00fcr zuk\u00fcnftige Forschungsvorhaben. Durch eine sich gegenseitig erg\u00e4nzende Kombination von Enzympr\u00e4paraten verschiedener Pilze sowie kommerzieller Enzyme wurden erste effektive Enzymcocktails generiert, mit deren Hilfe die partielle Zerlegung von Rapsstroh unter schonenden und umweltfreundlichen Bedingungen gelungen ist. Die Schl\u00fcsselenzyme des Substrat-Aufschlusses von P. sapidus und X. polymorpha wurden massenspektrometrisch identifiziert und k\u00f6nnen nun aus cDNA-Banken kloniert werden. Im Fall von X. polymorphabesteht noch weiterer Forschungsbedarf; zwar ist es gelungen enzymatische Schl\u00fcsselaktivit\u00e4ten anhand photometrischer Tests zu identifizieren, doch konnte aufgrund fehlender Sequenzinformationen in den verf\u00fcgbaren Datenbanken keine eindeutige Zuordnung der ge-fundenen Proteinfragmente erfolgen. Dennoch wurde durch das vorliegende Projekt die Grundlage f\u00fcr eine zuk\u00fcnftige heterologe Expression der erforderlichen Schl\u00fcsselenzyme gelegt. Diese wiederum bildet die Voraussetzung f\u00fcr den industriellen Einsatz von ma\u00dfgeschneiderten Enzymcocktails im gr\u00f6\u00dferen Ma\u00dfstab. Durch einen gezielten und gerichteten enzymatischen Aufschluss des Lignocellulose-Polymers wird eine stoffliche Verwertung der entstehenden aromatischen Ligninfragmente m\u00f6glich werden. Zur strukturellen Charakterisierung dieser Lignin-Abbauprodukte sollen zuk\u00fcnftig spezielle massenspektro-metrische und chromatographische Methoden sowie moderne NMR-spektroskopische Verfahren zum Einsatz kommen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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