Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel des beantragten Projekts ist es, neue Synthesewege f\u00fcr enantiomerenreine Verbindungen durch enzymkatalysierte Oxidations-Reaktionen im technischen Ma\u00dfstab zu entwickeln. Eine interessante, kosteng\u00fcnstige Ausgangsverbindung ist dabei das Glycerol (GLY), da diese Verbindung beispielsweise ein Abfallprodukt bei der Herstellung von Biodiesel ist. Ein geeignetes enzymatisches Verfahren zur Oxidation von GLY sollte aber auch grunds\u00e4tzliche Bedeutung f\u00fcr die selektive Oxidation homologer Polyole besitzen, die durch regioselektive Einf\u00fchrung von Keto- oder Aldehyd-Funktionen zu Ketose- oder Aldosezucker oder auch zu Zuckers\u00e4uren umgesetzt werden k\u00f6nnen. Durch die regioselektive enzymatische Oxidation von Polyolen kann man hier auf die Anwendung aufwendiger Schutzgruppen-Chemie verzichten.
\nEine Reihe solcher Produkte wird z.Zt. noch durch unvollst\u00e4ndige Oxidation mit Gluconobacter-St\u00e4mmen gewonnen, beispielsweise 5-Keto-D-Glucons\u00e4ure (Weins\u00e4ure-Vorstufe), 6-(2-Hydroxyethyl)amino-6-desoxy-L-sorbofuranose, einer Vorstufe von Miglitol (Diabetes-Mittel), L-Sorbose (Ascorbins\u00e4ure-Vorstufe), L-Ribulose oder (S)-2-Methylbutters\u00e4ure bzw. -ester davon als Aromastoffe. Diese Umsetzungen werden allerdings mit Wildst\u00e4mmen durchgef\u00fchrt, rekombinante Gluconobacter-Produktionssysteme sind nicht bekannt. Weitere in der Literatur beschriebene Anwendungen f\u00fcr Produkte, die durch Oxidation zug\u00e4nglich sind, betreffen die Synthese von (S)-1-Phenyl-1,2-ethandiol, (R)-1,3-Butandiol, (R)-3-Pentyn-2-ol, GA oder D-2-Hydroxypropans\u00e4ure. Teilweise handelt es sich hierbei um Racematspaltungs-Verfahren, wobei durch Oxidation die unerw\u00fcnschte Komponente entfernt wird.
\nZur Entwicklung von Verfahren entsprechend Abb. 1 m\u00fcssen eine Reihe von Voraussetzungen erarbeitet werden, wie beispielsweise:
\n–\tNeue regio- und stereoselektive Oxidoreduktasen zur Oxidation der Edukte
\n–\tEnzymatische Verfahren zur Regenerierung der Coenzyme NAD bzw. NADP
\n–\tQuantifizierbare Nachweisverfahren f\u00fcr die Produkte (GC, HPLC)
\n–\tVerfahrentechnik der gekoppelten Anwendung von oxidierenden und regenerierenden Enzymen
\n–\tVerfahrenstechnik der Oxidation (O2-Versorgung, gfl. Vermeidung der H2O2-Akkumulation
\n–\tAufarbeitung der Produkte aus w\u00e4ssrigen L\u00f6sungen
\n–\t\u00d6ko-Bilanzierung der enzymatischen Verfahren, Vergleich mit konventionellen (chemischen) Verfahren
\nEntsprechend dieser verschiedenen Anforderungen ist das Projektteam zusammengesetzt aus Chemikern, Biochemikern, Mikrobiologen, Verfahrenstechnikern und Wissenschaftlern einer KMU und einer Gro\u00dfindustrie, um durch aufeinander abgestimmte parallele Bearbeitung eine rasche Realisierung der Projektziele zu erreichen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIm Rahmen des beantragten Projekts sollen Dehydrogenase-basierte Reaktionen f\u00fcr die Oxidation eingesetzt werden, bevorzugtes Substrat ist Glycerol. Die wesentlichen Arbeitsschritte beinhalten:
\n– Entwicklung eines Verfahrens zur Oxidation von Glycerol zu Dihydroxyaceton
\n– Entwicklung eines Verfahrens zur Oxidation von Glycerol zu D- oder L-Glyceraldehyd
\n– Auswahl einer geeigneten Methode zur Regenerierung von NAD bzw. NADP
\n– Entwicklung von Ganzzell-Katalysatoren (Designer-Zellen) auf der Basis von E. coli.
\nUm diese Teilschritte durchzuf\u00fchren, werden folgende Methoden eingesetzt: \u00dcber Screeningverfahren werden neue Glycerol-oxidierende NAD(P)-abh\u00e4ngige Enzyme f\u00fcr das Projekt bereitgestellt, diese werden mit biochemischen Methoden gereinigt (chromatographische Reinigung, SDS-PAGE) und charakterisiert (Aminos\u00e4ure- und Nucleotid-Sequenzierung). F\u00fcr die Regenerierung von NAD oder NADP sollen vergleichend 4 verschiedene Methoden eingesetzt werden, die Leistungsf\u00e4higkeit wird durch Produktbildung am Gas-Chromatographen bewertet. Darauf basierend werden Ganzzell-Katalysatoren durch Anwendung molekularbiologischer Methoden konstruiert. Diese Designer-Zellen werden ebenfalls bez\u00fcglich ihrer Produktbildungsrate charakterisiert, gut geeignete Zellen werden dann f\u00fcr die Ausarbeitung eines technischen Verfahrens eingesetzt. F\u00fcr die Bewertung eines Up-Scalings werden verschiedene Reaktorkonzepte verglichen, dabei spielen dann auch industrie-relevante Parameter der \u00d6konomie und der \u00f6kologischen Bewertung eine wichtige Rolle.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Ziel des beantragten Projekts ist es, umweltschonende enzymkatalysierte Oxidations-Reaktionen zur Entwicklung neuer Synthesewege f\u00fcr enantiomerenreine Verbindungen im technischen Ma\u00dfstab am Beispiel der Oxidation von GLY auszuarbeiten.
\nVon GLY ausgehend sind zwei Oxidationsprodukte m\u00f6glich: Die Oxidation am C 2 f\u00fchrt zu DHA, bei Oxidation einer endst\u00e4ndigen OH-Funktion wird GA gebildet. Die Entwicklung einer enzymatischen Methode zur Bildung von DHA ist aus industrieller Sicht weniger attraktiv, es handelt sich hierbei um ein achirales, niedrigpreisiges Produkt, f\u00fcr das bereits Syntheseverfahren im Tonnen-Ma\u00dfstab bestehen. Da es aber auch ein Ziel dieses Projekts ist, eine Plattformtechnologie f\u00fcr enzymatische Oxidationen aufzubauen, hat diese Reaktion im Rahmen dieses Projekts Bedeutung als Modellreaktion, da es – zumindest f\u00fcr die Reaktion DHA zu GLY – bereits gut beschriebene Enzyme gibt. Diese Bewertung, dass die Bildung von GA im Rahmen dieses Projekts mit deutlich h\u00f6herer Priorit\u00e4t bearbeitet werden soll als die DHA-Bildung, entspricht im \u00dcbrigen auch dem Gutachtervotum des Kickoff-Meetings.
\nF\u00fcr die industriell attraktivere Umsetzung von GLY zu GA sind bislang weder enzymatischen Verfahren noch geeignete, gut charakterisierte Enzyme bekannt, so dass vor der eigentlichen verfahrenstechnischen Bearbeitung der Oxidation neue Enzyme isoliert werden mussten. Als hilfreich f\u00fcr dieses Screening hat sich ein Literaturhinweis erwiesen, in dem ein Enzym aus Hypocrea jecorina beschrieben wurde, das GA zu GLY reduziert. Durch Datenbank-Recherchen konnte die zugrunde liegende Sequenz identifiziert werden und diese dann als Grundlage f\u00fcr ein in silico-Screening genutzt werden. Mit dieser Methode konnten in kurzer Zeit mehrere neue GA-umsetzende Enzyme gefunden, kloniert und \u00fcberexprimiert werden. Neben dem Hypocrea-Enzym stehen damit mittlerweile zwei Enzyme aus Gluconobacter oxidans und eins aus Pseudomonas aeruginosa zur Verf\u00fcgung. Eine erste Charakterisierung hat gezeigt, dass diese Enzyme durchweg mit deutlich h\u00f6herer Aktivit\u00e4t GA reduzieren als umgekehrt durch Oxidation GA bilden. Diese sehr ung\u00fcnstige Gleichgewichtslage ist in einer Produktinhibierung der GlyDHs durch den gebildeten GA begr\u00fcndet. Da dieser Effekt bei allen identifizierten GlyDHs zu erkennen ist, wurden in einem zweiten Versuch Oxidasen als putative Kandidaten zur selektiven Oxidation von GLY genauer untersucht.
\nDabei konnten durch ein umfangreiches Anreicherungs-Screening sechs interessante Umweltisolate identifiziert werden. Bei einem ausgew\u00e4hlten besonders aktiven Kandidaten konnte sogar eine Pr\u00e4ferenz zur Bildung des L-Enantiomeres nachgewiesen werden.
\nDie entsprechenden Enzyme sollten mit Hilfe einer cDNA Bank identifiziert werden, bislang gelang es jedoch noch nicht, die Oxidasen zu identifizieren. Die Arbeiten hierzu werden noch nach Beendigung des DBU-Projektes fortgesetzt.
\nAufgrund der Tatsache das die Oxidasen noch nicht f\u00fcr die Entwicklung eines technischen Prozesses zur Verf\u00fcgung stehen, und die GlyDH eine starke Produktinhibierung in der Oxidation von GLY aufweisen musste nach Alternativen zur Produktion von enantiomerenreinem GA gesucht werden. Am vielversprechensten ist, bedingt durch die hohe Aktivit\u00e4t und Selektivit\u00e4t der GlyDHs, eine kinetische Racematspaltung von rac-GA. Dabei konnte die GDH zur Cofaktorregenerierung verwendet werden. Die Racematspaltung konnte durch die Konstruktion eines effektiven Ganzzellkatalysators zu einem technisch anwendbaren Prozess entwickelt werden, der enantiomerenreines L-GA als Produkt liefert.
\nDamit steht zum Abschluss des DBU-Projektes eine Methode zur enzymatischen Produktion von L-GA zu Verf\u00fcgung, die gegen\u00fcber der chemischen Synthese \u00f6konomisch und \u00f6kologisch von Vorteil ist. Am Beispiel dieser Methode konnte parallel eine Methode zur Produktisolation von L-GA entwickelt werden. Dabei wird L-GA durch eine Kationenaustausch-Chromatographie von den restlichen Komponenten des Reaktionsgemisches getrennt. Durch die Verwendung von Wasser mit geringen Mengen (5mM) an Trifluoressigs\u00e4ure als L\u00f6sungsmittel ist dieses Verfahren deutlich umweltfreundlicher als die sonst in der Chemie verwendeten Verfahren zur Produktisolation.
\nMit Hilfe beider entwickelten Prozesse gelang es im Rahmen diese DBU-Projektes enantiomerenreines L-GA im Grammma\u00dfstab zu produzieren.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Pressemitteilung der Firma evocatal zum Projektstart im Mai 2007 wurde \u00fcber den Firmenpresseverteiler an alle relevanten Medien und Interessenvertreter weitergeleitet.<\/p>\n
Vortr\u00e4ge
\nEggert, Th., Richter, N., Hummel, W., Liese, A., Neumann, M., Wohlgemuth, R (2008) Enantioselective biosynthesis of hydroxyketones catalyzed by novel glycerol dehydrogenases BioPerspectives 2008, Hannover.<\/p>\n
Puls, M. (2009) Enantioselective biosynthesis of hydroxyketones catalyzed by novel glycerol dehydrogenases. Biotrans 2009, Bern.<\/p>\n
Posterpr\u00e4sentationen
\nM. Neumann, N. Richter, W. Hummel, T. Eggert, R. Wohlgemuth, A. Liese. Production of Dihydroxyaceton and Glyceraldehyde in Enzymatic Redoxreactions. International Congress on Biocatalysis (biocat) 2008, Hamburg. <\/p>\n
Richter, N., Neumann, M., Liese,A., Wohlgemuth, R., Eggert, T., Hummel, W. (2009). Production of L-Glyceraldehyde by a new NADP-dependent Glycerol Dehydrogenase from Gluconobacter oxydans. Biotrans 2009, Bern.<\/p>\n
Patentanmeldungen
\nAlkoholdehydrogenase aus Gluconobacter oxydans und deren Verwendung
\nDE 10 2009 007 272 Anmelder: Fa. evocatal GmbH (2009)<\/p>\n
Publikationen
\nRichter, N., Neumann, M., Liese, A., Wohlgemuth, R., Eggert, T., Hummel, W. (2009) Characterisation of a recombinant NADP-dependent glycerol dehydrogenase from Gluconobacter oxydans and its application in the production of L-glyceraldehyde.
\nChemBioChem 10, 1888-1896<\/p>\n
Richter, N., Neumann, M., Liese, A., Wohlgemuth, R., Eggert, T., Hummel, W. (2009)
\nCharacterization of a whole-cell catalyst co-expressing NADP+-dependent glucose dehydrogenase and NADP+-dependent glycerol dehydrogenase and its application in the synthesis of L glyceraldehyde.
\nBiotechnol. Bioeng. (zur Ver\u00f6ffentlichung eingereicht)<\/p>\n
Neumann, M., Richter, N., Eggert, T., Hummel, W., Wohlgemuth, R., Liese, A. (2010)
\nPreparative biocatalytic production and isolation of L-Glyceraldehyde.
\nOrg. Proc. Res. Dev. (zur Ver\u00f6ffentlichung eingereicht)<\/p>\n
Diplom- und Doktorarbeiten
\nAnita Blanche Ogolong Mouessoune (2008) Screening, Aufreinigung und biochemische Charakterisierung neuer Glyceroldehydrogenasen. Diplomarbeit, FH Aachen<\/p>\n
Richter, Nina (2010) Neue Enzyme zur Synthese chiraler Bausteine (Arbeitstitel), Dissertation, Heinrich-Heine-Universit\u00e4t D\u00fcsseldorf<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Das \u00fcbergeordnete Projektziel, die Entwicklung eines umweltschonenden enzymkatalysierten Oxidations-Verfahrens zur Entwicklung neuer Synthesewege f\u00fcr enantiomerenreine Verbindungen im technischen Ma\u00dfstab wurde am Beispiel der C3-verbindung L-Glyceraldehyd (L-GA) vollumf\u00e4nglich erreicht. Mit Abschluss des DBU-Projektes steht eine Methode zur enzymatischen Produktion von L-GA zu Verf\u00fcgung, die gegen\u00fcber der chemischen Synthese \u00f6konomisch und \u00f6kologisch von Vorteil ist. Dar\u00fcber hinaus wurde eine Methode zur Produktisolation von L-GA entwickelt werden. Dieses Verfahren ist deutlich umweltfreundlicher als die sonst in der Chemie verwendeten Verfahren zur Produktisolation.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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