Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel des vorliegenden Projekts war die Erarbeitung eines alternativen L\u00f6sungsmittelkonzepts zur Anwendung in einer integrierten Aufarbeitung im Produktionsschritt. Die hier zugrundeliegende Strategie beruhte auf der Kombination sogenannter ionischer Fl\u00fcssigkeiten (IL) als L\u00f6sungsvermittler mit \u00fcberkritischen Fluiden als Extraktionsmittel, die den Vorteil einer kontaminationslosen Produktextraktion, einer umweltfreundlichen Rezyklierung der Zus\u00e4tze sowie eines erweiterten Einsatzes von Biokatalysatoren mit sich bringt. Zudem wurden neue Ans\u00e4tze f\u00fcr die biokatalytische Umsetzung von in Wasser unl\u00f6slicher oder schwerl\u00f6slicher Verbindungen und deren Aufarbeitung angestrebt. Das vorgestellte Konzept sollte f\u00fcr die biokatalytische Synthese von enantiomerenreinem 2-Octanol herangezogen werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Biokatalyse ist aufgrund ihrer Effizienz bei der chemischen Synthese nicht mehr wegzudenken. Sie bietet f\u00fcr viele Prozesse eine nachhaltige Alternative zu chemischen Synthesen. Allerdings stellt die unabdingbare w\u00e4ssrige Umgebung eine wesentliche Einschr\u00e4nkung f\u00fcr die Anwendbarkeit der Biokatalyse dar. Dies gilt insbesondere f\u00fcr technisch relevante Prozesse, da die erreichbare Raum-Zeit-Ausbeute und Produktivit\u00e4t von der L\u00f6slichkeit und der dadurch bedingten maximalen Reaktionsgeschwindigkeit abh\u00e4ngt.
\nZwei L\u00f6sungsans\u00e4tze und deren Kombination wurden f\u00fcr diese Problematik vorgeschlagen:
\n– IL erschienen aufgrund ihrer einstellbaren Eigenschaften geeignet, die oben genannten Probleme
\n zu \u00fcberwinden. F\u00fcr die anschlie\u00dfende Extraktion oder die integrierte Aufarbeitung k\u00f6nnen gezielt
\n Systeme gesucht werden, die die gew\u00fcnschten l\u00f6sungsvermittelnden Eigenschaften aufweisen,
\n ohne bei der Extraktion aus der w\u00e4ssrigen Phase zu st\u00f6ren.
\n– F\u00fcr scF als Extraktionsmittel war zu erwarten, dass die IL als L\u00f6sungsvermittler nicht extrahiert
\n werden. Es konnte in Vorarbeiten gezeigt werden, dass IL aufgrund ihres ionischen Charakters
\n und des nicht messbaren Dampfdrucks mit scF nicht extrahiert werden.
\n– Die Kombination dieser beiden Fluide er\u00f6ffnet die M\u00f6glichkeit, die jeweiligen Vorteile miteinander
\n zu verbinden und durch die Vermeidung von Abf\u00e4llen ein erhebliches Umweltentlastungspotenzial
\n zu schaffen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts war es m\u00f6glich, hochaktive und enantioselektive R-ADH-Mutanten zu erzeugen, deren Anwendbarkeit in Anwesenheit ionischer Fl\u00fcssigkeiten best\u00e4tigt wurde. Mit Hilfe umfangreicher Optimierungsprozesse konnten die Aktivit\u00e4ten bis zu einem Grad der technischen Anwendbarkeit gesteigert werden. Die Produktion der Biokatalysatoren konnte zum Projektende bereits im Rahmen von 300L-Fermentationen erfolgen. Von besonderer Wichtigkeit war die Identifizierung verschiedener IL, die eine ausreichende Kompatibilit\u00e4t mit dem Biokatalysator aufweisen. Zu diesem Zweck wurde zun\u00e4chst der Einfluss der verschiedenen IL auf die Kompatibilit\u00e4t mit einer Alkoholdehydrogenase untersucht. Dabei wurden besonders mit hydroxyfunktionalisierten terti\u00e4ren Ammoniumverbindungen gute Ergebnisse erzielt. Die meisten dieser IL sind – bei einer Dosierung von 10 Vol % im Reaktionsmedium – in der Lage das Enzym in L\u00f6sung zu stabilisieren, ohne seine Aktivit\u00e4t negativ zu beeinflussen. Dar\u00fcber hinaus wurden verschiedene Methoden zur Cofaktorregenerierung (elektrochemisch, enzymgekoppelt mit einer Malatdehydrogenase bzw. einer Glucosedehydrogenase) untersucht. Es zeigte sich, dass die Cofaktorregnerierung mit Hilfe der GDH f\u00fcr unsere Zwecke am besten geeignet ist. Anhand der Voruntersuchungen wurde die Auswahl an m\u00f6glichen IL reduziert. F\u00fcr eine IL wurden Synthesen mit 10, 25 und 50 Vol %-Anteile durchgef\u00fchrt, bei denen sich jedoch im Vergleich zur Synthese im reinen Puffer keine Verbesserung der Produktivit\u00e4ten zeigte. Detaillierte Kinetikuntersuchungen ergaben, dass f\u00fcr die ADH eine deutliche Produktinhibierung vorliegt, weshalb die Zugabe eines L\u00f6sungsvermittlers zur Verbesserung der Substratl\u00f6slichkeit nur dann vorteilhaft ist, wenn der L\u00f6sungsvermittler nicht auch die Produktl\u00f6slichkeit heraufsetzt. Da f\u00fcr das untersuchte Enzym die maximale Reaktionsgeschwindigkeit in Puffer schon bei einer Konzentration kleiner 8 mM (= maximale L\u00f6slichkeit im verwendeten Puffer) erreicht war, w\u00e4hrend gleichzeitig aufgrund der geringen L\u00f6slichkeit des Produkts zu hohe Konzentrationen desselben vermieden werden konnten, wurden zus\u00e4tzlich Versuche in reinem Puffer und mit Substrat als zweiter Phase durchgef\u00fchrt. In diesem Setup konnten folgende Ergebnisse realisiert werden: STY = 800 mmolL-1d-1 (= 103 gL-1d-1), ee > 99,9 %, TTNADH = 33300, TTNGDH = 13100, TTNNADP+ = 8000.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die im Rahmen des DBU-Kooperationsprojekts gewonnenen Erkenntnisse wurden auf der Messeveranstaltung ChemSpec 2008 CPhI 2008 pr\u00e4sentiert. Des Weiteren wurden die Ergebnisse im Rahmen des Graduiertenkollegs BioNoCo vorgestellt. In naher Zukunft werden Teile dieses Projektes auf der ACHEMA 2009, auf der DECHEMA-Tagung Biokatalyse: Neue Verfahren, neue Produkte sowie auf der Biotrans 2009 pr\u00e4sentiert. Die Ergebnisse der elektrochemischen Untersuchungen werden in F. Hildebrand, S. L\u00fctz, Chem. Europ. J. 2009, accepted. bzw. in C. Kohlmann, et al., J. Am. Chem. Soc. 2009, submitted. ver\u00f6ffentlicht. Au\u00dferdem sollen auch die Ergebnisse der Enzymcharakterisierung in Gegenwart ionischer Fl\u00fcssigkeiten und die Erkenntnisse bez\u00fcglich der Synthese von 2-Octanol in einem wissenschaftlichen Artikel publiziert werden. F\u00fcr die Verwendung ionischer Fl\u00fcssigkeiten als Stabilisatoren f\u00fcr Nicotinamidcofaktoren wurde eine Patentanmeldung (Kohlmann C, Greiner L, L\u00fctz S; DE 10 2008 061 866.7, 15.12.2008. Verwendung von ionischen Fl\u00fcssigkeiten sowie Sensor. Germany.) eingereicht. Eine weitere Patentanmeldung bez\u00fcglich des Einsatzes ionischer Fl\u00fcssigkeiten wird derzeit noch gepr\u00fcft.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Ionische Fl\u00fcssigkeiten stellen interessante Additive f\u00fcr die Biokatalyse dar. So k\u00f6nnen durch den Einsatz geeigneter IL die Enzym- und Cofaktorstabilit\u00e4ten deutlich gesteigert oder auch verbesserte Substratl\u00f6slichkeiten realisiert werden. Die Kombination dieser Additive mit einer selektiven Produktextraktion mit Hilfe von \u00fcberkritischen Fluiden stellt eine umweltentlastende Alternative zur chemischen Darstellung enantiomerenreiner Alkohole dar. Im Hinblick auf die zunehmende Bedeutung der Biokatalyse bei der Herstellung chiraler Verbindungen kann diese Erg\u00e4nzung der konventionellen chemischen Verfahren als zukunftsweisend eingesch\u00e4tzt werden und mit gro\u00dfer Wahrscheinlichkeit in die g\u00e4ngige Praxis biotechnologischer Produktionen integriert werden. Im Fall der enantioselektiven Reduktion von 2-Oktanon mit der verwendeten ADH ist allerdings kein Zusatz an IL n\u00f6tig um prozessrelevante Produktivit\u00e4ten zu erzielen. In diesem Fall scheint der Einsatz des Substrats als zweite Phase besonders vielversprechend. Das gebildete Produkt kann zwar durch Extraktion mit \u00fcberkritischem CO2 abgetrennt werden, da es sich jedoch bei Konzentrationen > 6 mM als separate Phase ausbildet, ist auch eine Abtrennung durch Phasentrennung m\u00f6glich. So ist man in der Lage auf zus\u00e4tzliche Additive und komplexe Reaktionsschritte zu verzichten, weshalb das Verfahren besonders umweltfreundlich und ressourcenschonend scheint. Das Konzept der Verwendung ionischer Fl\u00fcssigkeiten als L\u00f6slichkeitsvermittler f\u00fcr die biokatalytische Synthese chiraler Verbindungen mit anschlie\u00dfender Produktextraktion mittels \u00fcberkritischer Fluide wird derzeit f\u00fcr die Synthese weiterer chiraler Alkohole untersucht.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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