Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Die Einf\u00fchrung moderner Enzymtechnologien in der verarbeitenden Industrie f\u00fchrt zur Substitution umweltbelastender, energieaufw\u00e4ndiger und emissionsreicher chemischer Verfahren und chemisch synthetisch hergestellter Produkte durch \u00f6kologisch kompatiblere biotechnologische Alternativen. Der Schl\u00fcssel zu einer breiten Etablierung \u00f6konomisch und \u00f6kologisch vorteilhafter Prozesse liegt in der Verf\u00fcgbar-keit hocheffizienter und stabiler Biokatalysatoren. Aufgrund ihrer Bef\u00e4higung zum Aufschluss lignifizierter Biopolymere besitzen Pilze aus der Klasse der Basidiomyceten eine einzigartige Enzymausstattung. Zu den mehreren hundert potenziellen extrazellul\u00e4ren Basidiomyceten-Enzymen geh\u00f6ren u. a. Glycosida-sen, Peptidasen und Lipasen.
\nZiel des Projekts war es, dieses bisher ungenutzte biochemische Potenzial im Sinne einer Plattformtechnologie f\u00fcr Prozesse und Produkte der wei\u00dfen Biotechnologie verf\u00fcgbar zu machen. Dazu z\u00e4hlen die Entdeckung und biochemische Charakterisierung folgender Enzyme: prolinspezifische Peptidasen f\u00fcr den Einsatz in der Getr\u00e4nkeindustrie, Glykosidasen mit neuen katalytischen Eigenschaften ebenfalls zur Verwendung in der Getr\u00e4nkeindustrie, Lipasen und Esterasen f\u00fcr die Aromabiotechnologie, die Wasch-mittel-, Futtermittel- und Lebensmittelindustrie sowie polyvalente Peroxidasen zur Synthese von Fein-chemikalien. Ebenfalls sollte die Eignung der Enzyme f\u00fcr die aufgef\u00fchrten technischen Zwecke aufgezeigt werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Arbeiten zur Entdeckung sekretorischer Peptidasen, ?-1,3-Glucanasen und Peroxidasen aus Basidiomyceten umfassten zun\u00e4chst ein Screening in Emers- und Submerskulturen. Die Induktion erfolgte durch Zugabe von Cinerean (ein ?-1,3-Glucan aus Botrytis cinerea), von prolinhaltigen Proteinen bzw. von Anthocyanen zum jeweiligen Fermentationsmedium. Eine so identifizierte prolinspezifische Peptidase aus Wolfiporia cocos wurde zun\u00e4chst durch Ionentauschchromatographie und anschlie\u00dfende Gelpermeationschromatographie gereinigt. Das gereinigte Enzym wurde biochemisch charakterisiert, um beurteilen zu k\u00f6nnen, ob die Eigenschaften den Anforderungen zur Anwendung in der Getr\u00e4nkeindustrie gen\u00fcgen. Eine Glucanase aus Lentinellus cochleatus wurde bez\u00fcglich ihrer Aktivit\u00e4t charakterisiert und mit anderen, kommerziell erh\u00e4ltlichen Glucansen, verglichen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Folgende im Projektverlauf generierte Ergebnisse sind besonders hervorzuheben: Im Screening essbarer Basidiomyceten konnten drei der angestrebten Aktivit\u00e4ten identifiziert werden. So wurde eine Protease mit prolinspezifischer Aktivit\u00e4t aus Wolfiporia cocos, eine ?-1,3-Glucanase aus Lentinellus cochleatus und eine anthocyanentf\u00e4rbende Aktivit\u00e4t aus Cyathus striatus entdeckt. Die prolinspezifische Peptidase aus W. cocos wurde gereinigt, biochemisch charakterisiert und ihre technische Anwendbarkeit unter-sucht. Dieses Enzym weist im Hinblick auf eine technische Nutzung vielversprechende Eigenschaften auf. So liegen beispielsweise sowohl das Temperaturoptimum mit 40-50 \u00b0C als auch das pH-Optimum mit pH 3,5-5,5 in Bereichen, die das Enzym f\u00fcr einen Einsatz in der Getr\u00e4nkeindustrie pr\u00e4destinieren. Auch weist das Enzym die f\u00fcr industrielle Anwendungen notwendige Stabilit\u00e4t auf (ca. 80 % Restaktivit\u00e4t nach 6 Monaten Lagerung). Das Substratspektrum reicht von kleinen prolinhaltigen Peptiden \u00fcber Prola-mine verschiedenen Ursprungs (Reis, Weizen, Gerste, Mais) bis hin zu Casein. Die n\u00e4chsten Schritte werden darin bestehen, das Enzym im gr\u00f6\u00dferen Ma\u00dfstab zu gewinnen und die Applikation in den ver-schiedenen Bereichen zu konkretisieren. Die ?-1,3-Glucanase aus L. cochleatus weist ihre maximale Ak-tivit\u00e4t bei einem pH-Wert von 3,5 bis 5,5 und einer Temperatur von etwa 65 \u00b0C auf. Die chromatographi-sche Analytik, \u00fcber die sich der Abbau des Glucans \u00fcber Oligomere bis hin zur Glucose verfolgen l\u00e4sst, legt nahe, dass sich im Fermentations\u00fcberstand Exo- und Endoglucanase-Aktivit\u00e4ten \u00fcberlagern. Eine genauere Einordnung dieser Enzyme wird die noch ausstehende Charakterisierung der gereinigten Enzyme in Folgeprojekten ergeben. In den anwendungstechnischen Versuchen best\u00e4tigte sich die Erwartung, dass eine Kombination aus endo- und exo-Glucanase-Aktivit\u00e4t zu einer schnelleren Freisetzung von Glucose f\u00fchrt als der isolierte Einsatz einer der Aktivit\u00e4ten, nicht. Dies liegt vermutlich darin begr\u00fcndet, dass die verwendete Exoglucanse die generierten kleineren Glucanfragmente weniger gut als Substrat akzeptiert als hochmolekulares Glucan. Detailuntersuchungen hierzu stehen noch aus.
\nDas gew\u00e4hlte experimentelle Procedere hat sich bew\u00e4hrt, auch wenn die zur Sekretion der Enzyme notwenigen Fermentationszeiten l\u00e4nger als erwartet waren und sich die biochemische Charakterisierung, beispielsweise durch die komplexe Analytik des Glucanabbaus, als arbeitsaufw\u00e4ndiger als erwartet er-wies. Obwohl das geplante Programm dadurch nicht bis ins Detail abgearbeitet werden konnte, wurden wesentliche Fortschritte erzielt. Die wichtigsten Projektziele wurden erreicht, womit der Charakter des Projekts, n\u00e4mlich das biochemische Potenzial von Basidiomycetenenzymen im Sinne einer Plattformtechnologie aufzuzeigen, erhalten blieb.
\nAlle Projektpartner stimmen darin \u00fcberein, dass das Projekt au\u00dferordentlich erfolgreich verlief. Die Zusammenarbeit zwischen den Projektpartnern gestaltete sich sehr angenehm, konstruktiv und kooperativ. Die Kooperationspartner standen und stehen in regelm\u00e4\u00dfigem Kontakt, um Informationen und Ergebnis-se zeitnah auszutauschen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Bisher wurden keine Ergebnisse publiziert. Die Patentlage im Bereich der prolinspezifischen Protease wird derzeit im Detail gepr\u00fcft. Eine abschlie\u00dfende Bewertung liegt daher noch nicht vor. Die aktuelle Datenlage l\u00e4sst Publikationen zur prolinspezifischen Protease ebenso wie zur Glucanase aus Lentinellus cochleatus in peer-reviewed Journals erwarten.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Das Projekt konnte die auf den Vorarbeiten der Universit\u00e4t Hannover beruhende Erwartung, dass Basidiomyceten \u00fcber eine einzigartige Enzymausstattung verf\u00fcgen, mehr als best\u00e4tigen. Die Identifizierung und Charakterisierung der prolinspezifischen Protease aus W. cocos konnte nahezu abgeschlossen werden, so dass die Produktion im gr\u00f6\u00dferen Ma\u00dfstab sowie die Entwicklung von Verfahren zur Anwendung des Enzyms begonnen werden k\u00f6nnen. Das Anwendungspotenzial der in L. cochleatus identifizierten ?-1,3-Glucanase muss in weiterf\u00fchrenden Versuchsreihen getestet werden. Ob es sich bei dem in Cyathus striatus entdeckten, zur Anthocyanentf\u00e4rbung bef\u00e4higten Enzym um ein erfolgversprechendes handelt, muss sich noch zeigen<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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