Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Die Konversion von nachwachsenden Pflanzenmaterialien zu Bioethanol ist h\u00e4ufig noch nicht wirtschaftlich genug, da effiziente Enzymsysteme fehlen, um die Cellulose zu hydrolysieren und damit f\u00fcr die etha-nolische G\u00e4rung verf\u00fcgbar zu machen. Die Zahl der kommerziell erh\u00e4ltlichen Cellulasen ist sehr begrenzt und in der Regel handelt es sich um Enzyme des mesophilen Pilzes Trichoderma reesei. Um die Cellulose f\u00fcr den enzymatischen Abbau zug\u00e4nglich zu machen, wird meistens ein thermischer Hydrolyseschritt vorgeschaltet. Nachteil dieses Verfahrens ist die Bildung toxischer Nebenprodukte (Hydroxymethylfurfural, Furfural) und die sequentielle Vorgehensweise in zwei getrennten Schritten (thermische Hydrolyse + enzymatische Hydrolyse). In diesem Projekt soll daher ein Set geeigneter Enzymsysteme f\u00fcr die Bioethanolproduktion bereitgestellt werden, die die thermische und enzymatische Hydrolyse in einem Schritt bei Temperaturen zwischen 100\u00b0C – 200\u00b0C erm\u00f6glichen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenF\u00fcr die kombinierte thermische und enzymatische Hydrolyse sollten neuartige Enzymsysteme aus ther-mophilen Mikroorganismen identifiziert, isoliert und untersucht werden. Dazu wurden Boden- und Was-serproben, die aus hei\u00dfen Quellen der Azoreninsel Sao Miguel genommen wurden, f\u00fcr die Anreicherung cellulaseabbauender Mikroorganismen eingesetzt. Die aus den Anreicherungskulturen erstellten Microcom-Genombanken dienten als Quelle neuartiger thermostabiler Cellulasen. Zur Identifizierung weiterer cellulolytischer Enzyme wurden Reinkulturen der extremophilen Bakterien Anaerobranca gottschalkii und Fervidobacterium gondwanense untersucht. Die neu entdeckten Enzyme sollten unter Bedingungen ge-testet werden, wie sie im Projekt AZ 13157 (Integriertes Verfahren zur Gewinnung von Bioethanol aus nachwachsenden Rohstoffen: Verwertung von Roggenganzpflanzen durch innovativen thermisch-enzymatischen Aufschluss bei gleichzeitiger Biokonversion zu Ethanol und vollst\u00e4ndiger Nutzung des Ligninanteils) vorherrschen (Temperatur bis 200\u00b0C, 100 bar Druck)<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die auf der Azoreninsel Sao Miguel gewonnenen Boden- und Wasserproben aus hei\u00dfen Quellen (60\u00b0C – 90\u00b0C) Proben wurden aerob und anaerob auf Cellulose und Hemicellulose bei 70\u00b0C angereichert. Durch Herstellung von Microcom-Genombanken aus den Anreicherungskulturen der Azorenproben wurden drei thermostabile Cellulasen durch ein aktivit\u00e4tsbasiertes Screening bei 70\u00b0C identifiziert. Die f\u00fcr die Cellulasen kodierenden Gene wurden umkloniert und erfolgreich in E. coli exprimiert. Die rekombinanten Cellulasen wurden gereinigt und biochemisch charakterisiert. Durch eine vergleichende Untersuchung der Cel-lulasen wurde ein geeignetes Enzym ausgew\u00e4hlt, das durch Hochzelldichtefermentation im Gro\u00dfma\u00dfstab produziert wurde. Dieses Enzym wurde im Hochtemperatur-Druckreaktor zur Hydrolyse von Roggenstroh eingesetzt.
\nDas Genom des thermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii enth\u00e4lt zwei offene Leserah-men, die f\u00fcr putative Endoglucanasen kodieren. Die f\u00fcr die Endoglucanasen kodierenden Gene wurden kloniert und die rekombinanten Enzyme erfolgreich in aktiver Form in E. coli exprimiert.
\nDurch ein aktivit\u00e4tsbasiertes Screening der Genbank des thermophilen anaeroben Bakteriums Fervidobacterium gondwanense wurde eine weitere thermoaktive Cellulase identifiziert. Das Cellulase-Gen wur-de umkloniert und erfolgreich in E. coli exprimiert. Die Cellulase wurde anschlie\u00dfend f\u00fcr die kombinierte thermisch-enzymatische Hydrolyse von Roggenstroh eingesetzt.
\nDie identifizierten thermostabilen Cellulasen sind in einem breiten Temperatur- (40\u00b0C – 120\u00b0C) und pH-Bereich (pH 3 – pH 10) aktiv und nutzen ein weites Spektrum an l\u00f6slichen und unl\u00f6slichen Cellulose-Substraten.
\nDie neu entdeckten Enzyme wurden dem Projekt AZ 13157 (Integriertes Verfahren zur Gewinnung von Bioethanol aus nachwachsenden Rohstoffen: Verwertung von Roggenganzpflanzen durch innovativen thermisch-enzymatischen Aufschluss bei gleichzeitiger Biokonversion zu Ethanol und vollst\u00e4ndiger Nut-zung des Ligninanteils) zur Verf\u00fcgung gestellt. Zus\u00e4tzlich wurden die cellulolytischen Enzyme der Bio-catCollection (AZ 13131) zur Verf\u00fcgung gestellt, um sie den Hochschulen und der Industrie verf\u00fcgbar zu machen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Pr\u00e4sentationen
\nKatzer, M., St\u00f6\u00dfer, N., Minow, B. and Antranikian, G.: Microbial community genomics (Microcomgenomics) for discovery of novel cellulases. Poster VAAM Tagung, Osnabr\u00fcck, 01.-04.04.2007.
\nPiela, B. and Antranikian, G.: Novel thermoactive cellulases from the anaerobic thermophilic bacteria Anaerobranca gottschalkii and Fervidobacterium gondwanense. Vortrag VAAM Tagung, Osnabr\u00fcck, 01.-04.04.2007.
\nAntranikian, G. (2008): Industrial relevance of thermophiles and their enzymes. In: Thermophiles – Biol-ogy and Technology at high temperatures. Eds. Robb, F. et al., CRC Press, Boca Raton: Taylor & Fran-cis. S.113-160.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die Meilensteine des Projekts wurden weitestgehend erreicht. F\u00fcr die Herstellung von Anreicherungs- und Reinkulturenkulturen wurden die auf den Azoren gewonnenen Proben sowohl aerob als auch anae-rob auf verschiedenen Cellulose-Substraten angereichert. Der Einsatz von Microcomgenomics erwies sich dabei als sehr erfolgreich, so konnten durch die kombinierte Anreicherung und Herstellung von Metagenombanken aus Mischkulturen drei neuartige cellulolytische Enzyme identifiziert werden. Auf die Iso-lierung von celluloseabbauenden Reinkulturen wurde verzichtet, da durch das Screening der Microcom-Genombanken die Cellulasen bereits in rekombinanter Form identifiziert und isoliert wurden und somit gew\u00e4hrleistet wurde, dass die Proteine erfolgreich in E. coli exprimiert werden. Alternativ dazu wurde die Reinkultur des thermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii auf cellulolytische Aktivit\u00e4t un-tersucht, wobei eine weitere Cellulase identifiziert werden konnte. Die Untersuchung von Enzymmischun-gen wurde nicht durchgef\u00fchrt, da die identifizierten Cellulasen Endoglucanase-Aktivit\u00e4t zeigen und die weiteren, am Celluloseabbau beteiligten Enzyme (Exoglucanase, b-Glucosidase) bislang nicht identifiziert werden konnten. Zur Identifizierung weiterer cellulolytischer Enzyme wurde eine Genbank aus dem thermophilen Bakterium Fervidobacterium gondwanense erstellt, deren Screening zur Identifizierung einer weiteren rekombinanten Cellulase f\u00fchrte. Die Reinigung und Charakterisierung des Enzyms wurde ebenfalls erfolgreich abgeschlossen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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