Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel des Projekts ist die Entwicklung eines nachhaltig umweltgerechten und wirtschaftlichen Verfahrens zur enzymatischen Synthese biogener Amide. Die Zielverbindungen k\u00f6nnen aufgrund ihrer antimikrobiellen, antiinflammatorischen und oberfl\u00e4chenaktiven Eigenschaften sowohl in der Natur- und High-Tech-Kosmetik als auch der pharmazeutischen Industrie eingesetzt werden. Die Verbindungen (hierzu geh\u00f6ren u. a. N-Benzylamide, Ceramide, Anadamid, Oleamid und weitere sekund\u00e4re Amide) wurden bislang nicht durch enzymatische Synthesen gewonnen. Die derzeitig praktizierte chemische Synthese ist jedoch hinsichtlich eingesetzter Ausgangsstoffe, notwendiger Reaktionsbedingungen und sich bildender Nebenprodukte mit einer erheblichen Umweltbelastung verbunden. Ein besonderes Problem des chemischen Verfahrens ist die Bildung toxischer N-Nitrosamine. Das geplante biotechnologische Vorhaben, welches modellhaft eine Synthese biogener Amide ohne die genannten Verfahrensnachteile erm\u00f6glichen kann, setzt die Bereitstellung spezifischer, im Projekt zu generierender Enzyme voraus.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIm Rahmen des Projekts wurden im Arbeitsbereich des Projektpartners Universit\u00e4t Greifswald folgende
\nMethoden angewandt:
\n– Optimierung eines Hydrolase-Assays f\u00fcr das Amidase-Screening
\n– Etablierung einer GC\/MS-Analytik
\n– Etablierung einer HPLC-Analytik
\n– Etablierung einer Kapillarelektrophore-Analytik
\n– Screening nach Amidase-Aktivit\u00e4ten
\n– Entwicklung einer molekularbiologischen Methode mit hoher Mutationsrate
\n– Einsatz von spiked-Oligonukleotiden f\u00fcr die Kassettenmutagenese
\n– Etablierung einer Agarplattenmethode zur raschen Analyse der Bibliotheken <\/p>\n
Folgende Methoden wurden vom Projektpartner Dr. Rieks GmbH angewandt:
\n– Chemische Substratsynthese und Aufreinigung
\n– Etablierung der DC- und HPLC-Analytik (Edukte, Produkte)
\n– Etablierung der Analytik zur Detektion von Nitrosaminen
\n– Entwicklung antimikrobieller Assays
\n– Auswahl antimikrobieller Zielverbindungen
\n– Durchf\u00fchrung enzymatischer Modellsynthesen<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Zu Beginn der Projektlaufzeit wurden die Modellsubstrate (biogene Amide) in ausreichenden Quantit\u00e4ten synthetisiert und die notwendigen Analytiken mittels HPLC, GC und Kapillarelektrophorese etabliert. In enger Absprache zwischen den Projektpartnern Dr. Rieks GmbH und Universit\u00e4t Greifswald konnten alle relevanten Techniken etabliert werden. Muster der Verbindungen wurden von der Dr. Rieks GmbH an die Universit\u00e4t Greifswald \u00fcbergeben. Beim Projektpartner Dr. Rieks GmbH wurden verschiedene biogene Amide auf antimikrobielle Aktivit\u00e4ten untersucht. Dabei konnten insbesondere Amide der Zimts\u00e4ure, der Ferulas\u00e4ure, der Kaffees\u00e4ure und der \u00d6ls\u00e4ure als potenzielle Kosmetikwirkstoffe mit breitem antimikrobiellem Potenzial gegen gram-positive und -negative Bakterien, Hefen und Schimmelpilze identifiziert werden. Zimt- und Ferulas\u00e4ureamide zeigten zus\u00e4tzlich sehr gute UV absorbierende Eigenschaften.
\nIm Rahmen eines umfangreichen Screenings wurden vom Projektpartner Universit\u00e4t Greifswald zahlreiche Enzyme auf Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber den Modellsubstraten in einem im Hause etablierten und im Rahmen der Projektlaufzeit umfangreich optimierten Hydrolase-Assay erfolgreich im Mikrotiterplatten-Ma\u00dfstab eingesetzt. Da aber keines der Enzyme ausgepr\u00e4gte Aktivit\u00e4t in der Hydrolyse zeigte und da diese sehr wahrscheinlich nur geringe Syntheseaktivit\u00e4t aufweisen w\u00fcrden, standen diese Fragestellungen f\u00fcr den weiteren Projektverlauf Enzymdesignstudien im Vordergrund.
\nLeider musste der Kooperationspartner Dr. Rieks GmbH im Oktober 2008 Insolvenz anmelden, so dass von dieser Seite her keinerlei Daten mehr zur Verf\u00fcgung gestellt wurden, die vorliegenden Daten lagen bereits zum Zeitpunkt des Zwischenberichts vor.
\nEin Hochdurchsatz-Assay konnte etabliert werden, ebenso wie die Analytik mittels GC und HPLC. W\u00e4hrend einige Enzyme mittelm\u00e4\u00dfige hydrolytische Aktivit\u00e4t aufwiesen, waren die erzielten Ums\u00e4tze in der Synthesereaktion leider sehr gering. Nach der Insolvenz des Kooperationspartner Dr. Rieks GmbH r\u00fcckte dieses Ziel in den Hintergrund, die Arbeit konzentrierte sich auf die Charakterisierung der Bottleneck-Mutanten und die St\u00fctzung der praktischen Ergebnisse durch Computer-Docking-Versuche.
\nErfolgreich war die Etablierung einer Methode zur fokussierten gerichteten Evolution. Die Methode (genannt One-pot, Simple Methodology for Cassette Randomization and Recombination for Focused Directed Evolution, kurz OSCARR) wurde erfolgreich auf ein Modellenzym angewendet, um zun\u00e4chst die Kettenl\u00e4ngenspezifit\u00e4t zu ver\u00e4ndern. Die mit diesem Verfahren gefundene Mutation enth\u00fcllte einen Hotspot am Eingang zum aktiven Zentrum (Bottleneck). Durch rationales Proteindesign konnten weitere Mutanten erstellt werden, die sich in ihren Eigenschaften (Kettenl\u00e4ngenspezifit\u00e4t, Substratspezifit\u00e4t, Enantioselektivit\u00e4t) vom Wildtyp deutlich unterscheiden, so entstanden z. B. Mutanten, die hundertfach aktiver gegen\u00fcber p-Nitrophenylpalmitat sind als der Wildtyp, und die 1-Phenyl-1-propylacetat, 1-Phenyl-2-propylacetat und 1-Phenylethylacetat selektiver umsetzen. Durch computergest\u00fctztes Docking konnten die Ergebnisse untermauert werden. Durch die herk\u00f6mmliche Methode der epPCR konnte bei einem Screening einer vergleichbar gro\u00dfen Bibliothek kein Klon mit ver\u00e4nderter Kettenl\u00e4ngenspezifit\u00e4t gefunden werden, unter anderem, da die wichtigen Regionen GC-reich und somit f\u00fcr Mutagenese durch epPCR schwer zug\u00e4nglich waren. Diese Ergebnisse konnten zum Teil bereits publiziert werden, ein weiteres Manuskript befindet sich in Vorbereitung. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass die Pseudomonas fluorescens Esterase I Amidaseaktivit\u00e4t besitzt, ein Schnelltest deutet darauf hin, dass sie das industriell interessante Vince Lactam stereoselektiv umsetzt.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurde an einer Vielzahl von Fachvortr\u00e4gen auf nationalen und internationalen
\nKongressen und Messeveranstaltungen zur Verbreitung der Ergebnisse teilgenommen. Darunter sind
\nz. B.: Dechema-Workshop Hamburg-Harburg, BIEM Workshop Potsdam, Tagung Greifswald, Workshop
\nBremen, Biocat2008, Hamburg.
\nDie Ergebnisse des Projekts wurden auf internationalen Fachkongressen und in einer internationalen Fachzeitschrift mit Peer-Review-Begutachtung publiziert: Hidalgo, A., Schliessmann, A., Molina, R., Hermoso, J. and Bornscheuer, U.T. (2008): A one-pot, simple methodology for cassette randomisation and recombination for focused directed evolution. Protein Eng. Des. Sel., 21, 567-576.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Projektverlauf wurden alle relevanten Methoden (Synthese der biogenen Amide und deren Analytik; Mutagenesemethode) etabliert und einige Projektziele erreicht. Erste Untersuchungen zur antimikrobiellen Wirksamkeit der biogenen Amide verliefen sehr Erfolg versprechend. Leider musste der Kooperationspartner Dr. Rieks GmbH im Oktober 2008 Insolvenz anmelden, so dass von dieser Seite her keinerlei Daten mehr zur Verf\u00fcgung gestellt wurden, die vorliegenden Daten lagen bereits im zum Zeitpunkt des Zwischenberichts vor. Das Ziel der enzymatischen Herstellung biogener Amide wurde nicht in zufrieden stellendem Ma\u00dfe erreicht.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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