Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Aminos\u00e4uren sind wirtschaftlich wertvolle Produkte. Dies gilt insbesondere f\u00fcr die eng verwandten verzweigtkettigen Aminos\u00e4uren L-Leucin, L-Isoleucin und L-Valin, deren Herstellung einer besonders gro\u00dfen Wertsch\u00f6pfung unterliegt, und die unter anderem f\u00fcr pharmazeutische Zwecke in allerh\u00f6chster Rein-heit ben\u00f6tigt werden. Es ist deswegen das Ziel, ein Verfahren zu entwickeln, mit dem ausschlie\u00dflich eine der genannten Aminos\u00e4uren gebildet wird, ohne dass andere Aminos\u00e4uren oder weitere Nebenprodukte gebildet werden. Dadurch sind erheblich einfachere und somit umwelt- und ressourcenschonendere Aufarbeitungsverfahren n\u00f6tig,
\num das reine Endprodukt zu erhalten.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenEin gro\u00dfer Teil der Aminos\u00e4uren wird weltweit mit dem Bakterium Corynebacterium glutamicum hergestellt. Dabei spielen Transaminasen bei der Umwandlung der jeweiligen Ketos\u00e4ure zur Aminos\u00e4ure eine wesentliche Rolle. Eine Besonderheit der Transaminasen ist aber h\u00e4ufig ihre geringe Spezifit\u00e4t, sodass in bestimmten F\u00e4llen, wie z. B. der L-Leucinsynthese sich L-Valinbildung bislang kaum vermeiden l\u00e4sst. Es sollen deswegen zun\u00e4chst alle aus dem Genom bekannten Transaminasen von C. glutamicum als re-kombinante Proteine isoliert werden, um ihre Spezifit\u00e4t in vitro mit den verschiedenen Ketos\u00e4uren zu bestimmen. Anschlie\u00dfend soll eine Transaminase ausgew\u00e4hlt werden, um sie zu mutagenisieren und durch ein aufzubauendes in vivo Selektionssystem zusammen mit einem High Troughput Screening ein Mutein zu erhalten, das bevorzugt nur eine der drei Ketos\u00e4uren zur gew\u00fcnschten Aminos\u00e4ure animiert. Dieses Mutein wird biochemisch charakterisiert und zum metabolic engineering verbesserter St\u00e4mme eingesetzt. Anschlie\u00dfend wird deren Eignung in Fermentationen gepr\u00fcft, wobei besonderes Augenmerk auf die angestrebte vereinfachte und somit weniger umweltbelastende Aufarbeitung gelegt wird. Des Weiteren wird gezielt durch Bestimmung der Kristallstruktur und ortsgerichteter Mutagenese der Transaminase IlvE der Einfluss auf ein umweltschonenderes Aufarbeitungsverfahren gepr\u00fcft.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Es wurden zwanzig Proteine mit Transaminasemotiv aus Corynebacterium glutamicum isoliert und teilweise charakterisiert. Dabei wurden die Transaminasen AroT und HisC identifiziert, von denen wir feststellen konnten, dass sie als Nebenaktivit\u00e4t auch die Synthese der verzweigkettigen Aminos\u00e4ure L Leucin katalysieren. Durch gerichtete Enzymevolution konnte ein AroT-Mutein mit der Mutation M54L gewonnen werden, welches die L-Leucinvorstufe 2-Ketoisocaprons\u00e4ure mit nahezu verdoppelter katalytischer Effizienz von 59 M-1 s-1 umsetzt. Eine weitere Verbesserung, die die Nutzung eines Muteins zur ausschlie\u00dflichen Synthese von L-Leucin m\u00f6glich machen w\u00fcrde, gelang aber nicht. Demgegen\u00fcber konnte aber die L-Histidinol-phosphat-Transaminase HisC kristallisiert werden, und es wurde ein Strukturmodell mit einer Aufl\u00f6sung von 1,8 \u00c5 bestimmt. Dieses Modell gab in Verbindung mit Mutationen im aktiven Zentrum Aufschluss \u00fcber die an der Katalyse beteiligten Aminos\u00e4urereste, sodass auch hier Potenzial besteht, das Enzym weiter zu verbessern, um die spezielle Bildung einer der verzweigtkettigen Aminos\u00e4uren zu erreichen. Im Projekt urspr\u00fcnglich nicht vorgesehen, aber sehr erfolgreich, war die Verringerung des Nebenprodukts L-Alanin um bis zu 75 % bei der L-Valinbildung mit Corynebacterium glutamicum. Dies gelang durch Deletion der Gene der Transaminase C und der L-Alanin-Transaminase in einem L-Valin-Produktionsstamm.
\nDurch die Verbesserung des L-Valin akkumulierenden Stammes, konnte das Aufreinigungsverfahren erheblich optimiert werden. Durch die daraus resultierende Einsparung eines zweiten Aufreinigungsschrittes im Aufarbeitungsprozess kann bis zu 30 % weniger Wasser und 25 % weniger Energie eingesetzt werden. Da zus\u00e4tzlich auch eine gesteigerte Produktausbeute von ca. 15 % erreicht werden konnte wirkt sich die optimierte Zuckerverwertung nicht nur kosteng\u00fcnstig, sondern auch umweltschonend durch Einsparung von Ressourcen aus. Als weitere Verbesserung im Downstreamprocessing konnte ein innovatives Extraktionsverfahren im Technikumsma\u00dfstab demonstriert werden, wobei durch Einsatz minimaler Mengen Chemikalien die Umweltbelastung nachhaltig vermindert werden kann.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
–\tMarienhagen J, Sandalova T, Eggeling L, Sahm H, Schneider G (2008) Insights into the structural basis of substrate recognition by histidinol-phosphate aminotransferase from Corynebacterium glutamicum. Acta Crystallogr. D Biol. Crystallogr. 64:675-85
\n–\tMarienhagen J, Eggeling L (2008) Aminotransferases AlaT and AvtA of Corynebacterium glutami-cum: Metabolic Function and Impact on L-Valine Production. Appl. Environ. Microbiol.(submitted)
\n–\tMarienhagen J, Eggeling L, Sahm H (2006) Verfahren zur fermentativen Herstellung von L-Aminos\u00e4uren unter Verwendung coryneformer Bakterien. WO Patentanmeldung CT\/DE2006\/000685 vom 20.04.2006
\n–\tMarienhagen J, Sahm H, Eggeling L (2006) Untersuchungen zur Struktur und Funktion von Transaminasen aus Corynebacterium glutamicum. Perspectives 2006, D\u00fcsseldorf
\n–\tMarienhagen J, Sandalova T, Eggeling L. Schneider G. (2007) Functional Analysis of all Aminotransferase Proteins of Corynebacterium glutamicum. VAAM 2007, Osnabr\u00fcck
\n–\tMarienhagen J, Eggeling L (2007) Structure and Function of Transaminases of Corynebacterium glu-tamicum. VAAM 2008, Frankfurt<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Durch die Arbeiten ist es gelungen, einen umfassenden Einblick in die Funktion und Bedeutung einzelner Transaminasen f\u00fcr die Aminos\u00e4urebildung mit Corynebacterium glutamicum zu gewinnen. Es gelang die Substratspezifit\u00e4t der Transaminase AroT zu ver\u00e4ndern und die Kristallstruktur der Transaminase HisC zu bestimmen. Ferner gelang es durch genetische Arbeiten zwei Transaminasen auszuschalten und dadurch einen L-Valin Produktionsstamm erheblich zu verbessern. Indem die L-Valinausbeute erh\u00f6ht wird und zudem weniger von der Begleitaminos\u00e4ure L-Alanin gebildet wird, ist ein erheblich einfacheres und somit umwelt- und ressourcenschonenderes Aufarbeitungsverfahren erforderlich, um das reine Endprodukt L-Valin in Infusionsqualit\u00e4t zu gewinnen<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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