Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Das prim\u00e4re Screening und Kultivierungen von Produktionsorganismen werden \u00fcberwiegend in gesch\u00fcttelten Bioreaktoren in der Batch-Betriebsweise durchgef\u00fchrt. Die meisten biotechnischen Produktionsprozesse werden hingegen in der Fed-Batch-Betriebsweise durchgef\u00fchrt. Die Unterschiede in den beiden Betriebsweisen im Screening und der Produktion f\u00fchren zu einer falschen Auswahl von Produktionsst\u00e4mmen. Um den Unterschieden in den Betriebsweisen zwischen dem Screening und der Produktion zu begegnen, sollten in diesem Projekt innovative Freisetzungssysteme zur Fed-Batch-Kultivierung von Mikroorganismen entwickelt und getestet werden. Damit sollte es m\u00f6glich sein, moderne industrielle Produk-tionsverfahren m\u00f6glichst ressourcen- und energieschonend sowie unter Erzielen maximaler Ausbeuten zu realisieren.
\nEin weiteres Ziel dieses Projekts war die Entwicklung von Mikrotiterplatten (MTP), die mit Hilfe von Frei-setzungssystemen eine Fed-Batch-Kultivierung erm\u00f6glichen und die aufgrund ihrer einfachen Handhabung und Parallelisierbarkeit die am h\u00e4ufigsten eingesetzten Reaktionsgef\u00e4\u00dfe im Bereich des Prim\u00e4rsc-reenings sind. Weiterhin sollten Freisetzungssysteme mit pH-Stellmitteln zur pH-Kontrolle in Kleinkulturen entwickelt werden, um ung\u00fcnstige hohe Pufferkonzentrationen in Kulturmedien zu reduzieren.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Arbeitspakete dieses Projekts wurden in drei Teilbereiche aufgeteilt und bearbeitet.
\n–\tEntwicklung von Mikrotiterplatten mit am Boden immobilisierten, glucosehaltigen Freisetzungssystemen und Fed-Batch-Kultivierung von Mikroorganismen mit Hilfe der neuen Mikrotiterplatten.
\n–\tEntwicklung von Systemen zur Freisetzung von pH-Stellmitteln und Kultivierung von Mikroorganismen unter Anwendung der Freisetzungssysteme zur pH-Kontrolle
\n–\tWeiterentwicklung der Natriumcarbonat-Freisetzungssysteme mit Beschichtungen zur Einf\u00fchrung einer lag-time und mit pH-sensitiven Polymeren zur Erzeugung von reaktiven Freisetzungskinetiken von pH-Stellmitteln.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
In diesem Projekt wurde ein Herstellungsverfahren f\u00fcr Mikrotiterplatten mit am Boden immobilisierten Glucosefreisetzungssystemen entwickelt. Mit Hilfe dieses Verfahrens k\u00f6nnen MTP mit reproduzierbarer Freisetzungskinetik hergestellt werden. F\u00fcr Freisetzungssysteme mit einem Glucosegehalt von 40 Gew.-% konnte dabei eine Freisetzung von ca. 8 mg Glucose \u00fcber einen Zeitraum von 24 h mit einer Stan-dardabweichung innerhalb der Kavit\u00e4ten einer MTP von \u00b17 % und einer Standardabweichung von \u00b12 % zwischen dem Durchschnitt jeweils zweier MTP. F\u00fcr die MTP wurde eine Einzelverpackung ausgew\u00e4hlt in der die MTP durch Gamma-Sterilisation sterilisiert und gelagert werden k\u00f6nnen. Durch die Sterilisation wird der Verlauf der Freisetzung leicht verlangsamt und linearisiert. Mit den neuen MTP war es m\u00f6glich in einfacher Weise einen Fed-Batch-Prozess im Mikroliterma\u00dfstab durchzuf\u00fchren. Dabei stand das Prim\u00e4rscreening von Produktionsst\u00e4mmen als klassische Hochdurchsatzanwendungen im Vordergrund der in diesem Projekt durchgef\u00fchrten Arbeiten. Zur Vorbereitung eines Screenings konnte ein neuer, bisher nicht in der Literatur beschriebener Ansatz zur Synchronisation von Vorkulturen entwickelt werden. Hier-bei wurde mit den Glucosefreisetzungssystemen ein synchrones Wachstum der Biomasse in MTP und somit homogene Ausgangsbedingungen f\u00fcr ein nachfolgendes Screening erreicht. Kultivierungen in Fed-Batch-Platten im Vergleich zu konventionellen Batch-Kultivierungen im Mikroma\u00dfstab haben gezeigt, dass Screeningprozesse von Produktionsst\u00e4mmen in unterschiedlichen Betriebsweisen zu h\u00f6chst unterschiedlichen Ergebnisse f\u00fchren. Des Weiteren wurde gezeigt, dass in einem konventionellen Batch-Screening von H. polymorpha mit Glycerin als Kohlenstoffquelle nicht der optimale Produktionsstamm identifiziert werden kann. Neben den beschriebenen Fed-Batch-Platten wurden in diesem Projekt Freisetzungssysteme zur Abgabe von pH-Stellmitteln entwickelt, mit denen der pH-Verlauf in mikrobiellen Kultivierungen kontrolliert werden kann. Dabei wurden zun\u00e4chst Freisetzungssysteme auf der Basis von Siliconfolien mit Natriumcarbonatgehalten von 20 bis 50 Gew.-% hergestellt und die Freisetzung und Quellung untersucht. Dabei zeigte sich ein Mechanismus, der bereits in vergleichbaren Systemen mit Glucose gefunden wurde: durch die Einlagerung von Wasser in das System und dem aufgebauten osmo-tischen Druck wird eine Quellung der Siliconmatrix und kleine Risse im Material verursacht, die als Pfad f\u00fcr die Freisetzung der hochwasserl\u00f6slichen Wirkstoffe dienen. Zudem kommt es bei zunehmendem Par-tikelgehalt der Matrix zur Percolation der Matrix mit Freisetzungsmedium. Diese Freisetzungssysteme wurden insbesondere mit Natriumcarbonatgehalten von 30 und 35 Gew.-% zur Untersuchung ihres Einflusses auf die Fermentation genutzt. Mit den Natriumcarbonat-Freisetzungssystemen wurden Experimente mit E. coli in Sch\u00fcttelkolben durchgef\u00fchrt und durch die Abgabe von Natriumcarbonat an das Kul-tivierungsmedium dem Absinken des pH-Werts w\u00e4hrend der Fermentation entgegenzuwirken. Durch die richtige Wahl der Kultivierungsbedingungen und der Anwendung von Freisetzungssystemen in Form von Folienscheiben mit 30 Gew.-% Natriumcarbonat, konnte mit Glycerin und Glucose als Kohlenstoffquellen ein vergleichbares Wachstum der Bakterien bei deutlich verringerter Pufferkonzentration erreicht werden. Die ben\u00f6tigten Pufferkonzentrationen konnten von den herk\u00f6mmlichen 0,2 M MOPS auf 0,1 M MOPS verringert werden. Mit Hilfe des freigesetzten Natriumcarbonats konnte der pH-Verlauf w\u00e4hrend der Kulti-vierung in einem f\u00fcr den Organismus vertr\u00e4glichen pH-Bereich gehalten werden. Mit Glucose als Kohlen-stoffquelle konnte mit den so verbesserten Kultivierungsbedingungen ein verst\u00e4rktes Wachstum mit einer um 17 % erh\u00f6hten Biomassebildung erreicht werden. Ein weiterer Schwerpunkt des Projekts war die Weiterentwicklung der Natriumcarbonat-Freisetzungssysteme in zwei Richtungen: Zum einen wurden die etablierten Freisetzungssysteme durch eine zus\u00e4tzliche Siliconmembran beschichtet, zum anderen wurde durch die Einf\u00fchrung eines pH-sensitiven Polymers ein Freisetzungssystem entwickelt, dass auf den \u00e4u\u00dferen Reiz mit Absinken des pH-Werts durch Freisetzung von Natriumcarbonat reagiert. Durch die Beschichtung der carbonathaltigen Siliconfolienscheiben mit einer zus\u00e4tzlichen Siliconmembran konnte eine lag-time eingef\u00fchrt werden. Diese betr\u00e4gt abh\u00e4ngig vom Natriumcarbonatgehalt der Siliconfolienscheiben zwischen 4 und 12 h und steigt mit abnehmendem Carbonatanteil. Mit einem Natriumcarbonatgehalt der Folienscheiben von 40 Gew.-% und einer Siliconmembran mit einer Schichtdicke von 50 \u00b5m konnte der durch eine Simulation einer Fermentation ermittelte Bedarfsverlauf an Natriumcarbonat gerade im An-fangsbereich der Freisetzung bzw. Kultivierung exakt abgebildet werden. Durch die Einf\u00fchrung eines pH-sensitiven Polymers konnte ein Freisetzungssystem entwickelt werden, das auf das Absinken des pH-Werts (im durchgef\u00fchrten Experiment unter pH=4) mit einer Aussch\u00fcttung von Natriumcarbonat reagiert und den pH-Wert innerhalb von 1 bis 2 h wieder anhebt (im durchgef\u00fchrten Experiment auf \u00fcber pH=6).
\nIn exploratorischen Untersuchungen wurde zudem der Einfluss der Netzwerkeigenschaften der Siliconmatrix auf das Freisetzungsverhalten untersucht. Diese Untersuchungen wurden an glucosehaltigen Siliconfreisetzungssystemen durchgef\u00fchrt und es konnte gezeigt werden, dass durch geringere Molmassen der eingesetzten Praepolymere sowie eine st\u00e4rkere Vernetzung des Silicons eine Verlangsamung der Freisetzung erzielt werden kann. Die Ergebnisse k\u00f6nnen beispielsweise f\u00fcr die Weiterentwicklung der Si-liconmembran genutzt werden.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die Forschungsergebnisse aus diesem Projekt wurden von Prof. Dr.-Ing. B\u00fcchs bei verschiedenen Konferenz- und Firmenpr\u00e4sentationen dargestellt. Weiterhin wurde ein deutsches Patent zu den Fed-Batch-Mikrotiterplatten eingereicht. Die MTP mit Freisetzungssystemen wurden erfolgreich in ein marktf\u00e4higes Produkt \u00fcberf\u00fchrt und werden von der Adolf K\u00fchner AG (Biersfelden, Schweiz) vertrieben.
\n–\tB\u00fcchs, J.; Jeude, M.; Klee, D.; Dittrich, B.: Fed-batch Microwellplatte (FEBMWP), German patent application 18.5.2005, DE 10 2005 022 045 A1
\n–\tJeude, M.; Dittrich, B. et al. (2006): Fed-batch mode in shake flasks by slowrelease technique. Biotechnol Bioeng 95(3): 433-45.
\n–\tScheidle, M.; Klinger J. et al. (2007): Combination of Online pH and Oxygen Transfer Rate Measurement in Shake Flasks by Fiber Optical Technique and Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS). Sensors 7: 3472-3480.
\n–\tJeude, M.; Dittrich, B.; Niederschulte, H.; Anderlei, T.; Knocke, C.; Klee, D. and B\u00fcchs, J.: Fed-batch mode in shake flasks by slow-release technique. Biotechnol Bioeng, 2006. 95(3), 433-45.
\n–\tScheidle, M.; Klinger, J. and B\u00fcchs, J.: Combination of On-line pH and Oxygen Transfer Rate Measurement in Shake Flasks by Fiber Optical Technique and Respiration Activity MOnitoring System (RAMOS). Sensors, 2007. 7, 3472-3480.<\/p>\n
Pr\u00e4sentationen auf Konferenzen und Firmenvortr\u00e4ge \u00fcber Freisetzungssysteme in der Biotechnologie:
\nAkademie der Wissenschaften D\u00fcsseldorf 14.07.2004; Firma Boehringer Ingelheim Biberach 03.08.2004; Max-Planck-Institut, Magdeburg, 09.08.2004; Firma Rhein Biotech, D\u00fcsseldorf, 26.08.2004; UFZ Leipzig 22.09.2004; Firma Eurogentec Liege 11.03.2005; Firma Degussa Hanau 15.03.2005; BioPerspectives Wiesbaden 09.05.2005; Firma Direvo, K\u00f6ln 08.07.2005; ECB 12 Koppenhagen 12, 24.08.2005; HPWN conference, Haren, NL, 05.09.2005; Firma Genencor Leiden, NL, 30.09.2005; RAFT VI meeting, Long Beach, USA, 06.11.2005; VAAM Tagung, Jena, 18.03.2006; Firma DowAgroSciences Indianapolis 22.-23.03.2006; From ?L to m3 DECHEMA Frankfurt 28.03.2006; Institutskolloquium IBT II, J\u00fclich, 13.09.2006; BioPerspectives, Wiesbaden, 27.09.2006; Firma Bayer Technology Services 12.01.2007; Bi-omedica, Aachen, 22.03.2007; Firma Sandoz, Kundl, \u00d6sterreich, 29.03.2007; BioPerspectives, K\u00f6ln, 31.05.2007; ECB 13, Barcelona, 19.09.2007; Jap\/Germ Workshop Enzyme Technol., Kanazawa, Japan, 10.10.2007; Lehrstuhlseminar bei Prof. Bley Dresden 14.12.2007; Biotec Research Institute, Bangkok, Thailand, 13.02.2008; Firma Ajinomoto, Bangkok, Thailand, 14.02.2008; TGGS, Bangkok, Thailand, 16.02.2008.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
In diesem Projekt konnten erfolgreich neue Methoden zum Screening von Mikroorganismen entwickelt werden. Die Relevanz und verschiedene Anwendungsm\u00f6glichkeiten von Systemen zur Freisetzung von Glucose und pH-Stellmitteln konnte, besonders f\u00fcr eine verbesserte Stammauswahl, demonstriert werden. Eine Verbesserung der Stammauswahl kann die Produktivit\u00e4t von Produktionsprozessen erh\u00f6hen, sodass eine bessere Verwertung von Medienbestandteilen erreicht wird. Dadurch k\u00f6nnen die Kosten ei-nes Prozesses und die Belastung von Abw\u00e4ssern mit nicht verbrauchten Medienbestandteilen reduziert werden. <\/p>\n
In weiteren Arbeiten sollen die Erkenntnisse aus diesem Projekt weiter vertieft werden. Ein Schwerpunkt soll dabei die Anwendung der Systeme mit reaktiven Kinetiken zur Freisetzung von pH-Stellmitteln in mikrobiellen Kultivierungen sein. Des Weiteren verspricht der verfolgte Ansatz mit einer Kombination von Glucose- und pH-Stellmittel-Freisetzungssystemen weitere M\u00f6glichkeiten zur Optimierung von Scree-ningprozessen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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