Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Biokatalytische Oxyfunktionalisierungen sind, dank milder Reaktionsbedingungen, dem Verzicht auf Edel- und Schwermetallkatalysatoren und der hohen chemischen Selektivit\u00e4t, hinsichtlich einer nachhaltigen Umweltentlastung eine vielversprechende Alternative zu chemisch-katalytischen Prozessen. Die erfolgreiche industrielle Anwendung der Biokatalyse bedingt jedoch hohe Raum-Zeit-Ausbeuten und diese wiederum gen\u00fcgend hohe Biokatalysatoraktivit\u00e4ten und -stabilit\u00e4ten. Die Isolierung und Gewinnung der oxyfunktionalisierten Produkte durch effektives und umweltvertr\u00e4gliches Downstream-Processing (DSP) ist eine weitere Grundvoraussetzung f\u00fcr die industrielle Realisierung biokatalytischer Verfahren. Im vorliegenden Projekt sollen Aktivit\u00e4t und Stabilit\u00e4t (NADH-Regeneration) eines Ganzzell-Biokatalysators zur stereospezifischen Styrolepoxidierung durch Metabolismusanalyse und Metabolic Engineering untersucht und optimiert werden. Gleichzeitig soll ein integriertes Prozessf\u00fchrungskonzept bestehend aus Trenntechnologien in \u00fcberkritischem\/fl\u00fcssigem CO2 eine effiziente und umweltfreundliche Produktaufarbeitung aus dem bestehenden Emulsionsprozess erlauben. F\u00fcr biokatalytische Hydroxylierungen soll au\u00dferdem eine weitere Enzymklasse (Dehydrogenasen) mit dem Potenzial, Limitationen durch Sauerstofftransfer und Kofaktorregeneration zu vermeiden, evaluiert und in das breit angelegte Prozessf\u00fchrungskonzept integriert werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenF\u00fcr die Styrolepoxidation werden rekombinante, Styrolmonooxygenase (StyAB) enthaltende E. coli in Zweiphasensystemen mit verschiedenartigen organischen Phasen eingesetzt. Hierf\u00fcr soll die \u00d6koeffizienz analysiert und optimiert werden. Die metabolische Flussanalyse soll m\u00f6gliche Limitationen identifizieren. Genetic Engineering im Bereich kofaktorregenerierender Enzyme und\/oder deren Regulation soll h\u00f6here Produktivit\u00e4ten und Stabilit\u00e4ten erlauben. F\u00fcr die Anwendung der Dehydrogenasen werden geeignete Expressionssysteme entwickelt und in geeigneten Wirten eingesetzt. Die Prozessentwicklung umfasst hier neben dem DSP auch Kultivations- und Reaktionsbedingungen. Zur Produktextraktion mit \u00fcberkritischem CO2 aus der Emulsion wird eine Kombination aus SFE (Supercritical Fluid Extraction) und SFC (Supercritical Fluid Chromatography) entwickelt. CO2 soll auch zur Phasentrennung zum Einsatz kommen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Biokatalytische Oxyfunktionalisierungen sind, dank milder Reaktionsbedingungen, dem Verzicht auf Edel- und Schwermetallkatalysatoren und hoher chemischer Selektivit\u00e4t, hinsichtlich einer nachhaltigen Umweltentlastung eine vielversprechende Alternative zu chemisch-katalytischen Prozessen. Innerhalb des hier vorgestellten Projekts wurde beispielhaft die \u00d6koeffizienz eines in einem Vorprojekt (AZ 13095) entwickelten und auf rekombinanten E. coli basierenden Prozesses zur enantioselektiven Styrolepoxidierung durch die BASF und extern durch E. Heinzle (Universit\u00e4t Saarbr\u00fccken) evaluiert. Im Vergleich zur chemischen Prozessalternative schnitt der Bioprozess \u00f6konomisch in beiden Studien \u00f6kologisch jedoch nur in der Studie aus Saarbr\u00fccken positiv ab. Die Studien sahen in Bezug auf das im Zweiphasenprozess verwendete L\u00f6sungsmittel und das Wachstumssubstrat gro\u00dfes Verbesserungspotenzial. Biodiesel bzw. Ethyloleat und Glyzerin wurden erfolgreich als Alternativen zu BEHP und Glukose eingesetzt. Dabei wurden \u00fcber 8-9 h Reaktionszeit durchschnittliche Produktivit\u00e4ten von 3-5 g\/Ltot\/h erreicht. Die Analyse der \u00d6koeffizienz zeigte, dass sich diese Verfahrens\u00e4nderungen in der Tat sehr positiv auf die \u00d6koeffizienz des Prozesses auswirken.
\nMetabolische Flussanalysen zeigten einen sehr hohen biokatalysebedingten NADH-Verbrauch, welcher zu einer NADH-Limitation in wachsenden Zellen f\u00fchrte. Aufgrund dessen wurde eine Zitratzyklusmutante getestet, die in der Tat vielversprechende Resultate wie die Reduzierung der Essigs\u00e4ureproduktion und die Erh\u00f6hung der Produktivit\u00e4t zeigte.
\nMit der Chance Limitationen durch O2-Transfer und NADH zu umgehen, wurden Wasser einbauende Dehydrogenasen in verschiedenen Pseudomonas-St\u00e4mmen zur Hydroxylierung von N-Heteroaromaten mit einer Aktivit\u00e4t von bis zu 54 U\/gCDW erfolgreich eingesetzt. F\u00fcr 4-Hydroxychinaldin wurde zudem ein vielversprechender Zweiphasenprozess entwickelt.
\nAls eine Hauptlimitation f\u00fcr die industrielle Implementierung zweiphasiger Bioprozesse gilt vor allem die aufw\u00e4ndige Phasentrennung. Hier wurde \u00fcberkritisches CO2 sowohl zur Phasentrennung als auch zur Produktextraktion erfolgreich eingesetzt. Es konnte gezeigt werden, dass eine Phasentrennung der stabilen Emulsion mit \u00fcberkritischem Kohlendioxid m\u00f6glich und technisch realisierbar ist. Zudem wurde eine auf einer Hochdrucksichtzelle basierende Versuchsanlage aufgebaut, mit der die L\u00f6slichkeiten der beteiligten Komponenten in Kohlendioxid ermittelt werden konnten. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass es m\u00f6glich ist, das Wertprodukt direkt aus der organischen Phase zu extrahieren.
\nF\u00fcr die kontinuierliche Aufarbeitung der Emulsion bzw. der organischen Phase wurde eine pr\u00e4parative SFE\/SFC-Anlage entwickelt und gebaut. Mit dieser Anlage und auf der Basis der ermittelten Extraktionsdaten konnte gezeigt werden, dass das Wertprodukt \u00fcber mehrere Trennstufen effizient extrahiert werden kann. Die gleichzeitige Extraktion des Nebenprodukts (2-Phenylethanol) sowie des Induktors (n Oktan) erlaubt eine effiziente R\u00fcckf\u00fchrung des organischen L\u00f6sungsmittels (BEHP).<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Eine Publikation mit dem Titel NADH Availability Limits Asymmetric Biocatalytic Epoxidation in Growing Recombinant Escherichia coli wurde in AEM ver\u00f6ffentlicht. Weitere Publikationen bez\u00fcglich DSP und \u00d6koeffizienz sind geplant. Pr\u00e4sentationen bez\u00fcglich des Projekts umfassen Vortr\u00e4ge und Poster an verschiedenen Tagungen, darunter die GVC\/DECHEMA-Jahrestagung, 27.09.2006, Wiesbaden, die European BioPerspectives 2007, 31.05.2007, K\u00f6ln, die Tagung High Pressure meets Advanced Fluids, 10.-11.03.2008, Aachen, das 11. European Meeting on Supercritical Fluids, 04.-07.05.2008, Barcelona, die Biotrans, 08.-13.07.2007, Oviedo, das 2. International Symposium on Biothermodynamics, 21.-22.02.2008, Frankfurt, die Gordon Research Conference on Biocatalysis, 06.-11.07.2008, Smithfield, RI, USA, das 7th European Symposium on Biochemical Engineering Science, 07.-10.09.2008, Faro, Portugal, und die European BioPerspectives 2008, 07.-09.10.2008, Hannover.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Ethyloleat und Glyzerin wurden w\u00e4hrend der Styrolepoxidation erfolgreich als Alternativen zu BEHP und Glukose eingesetzt. Diese \u00c4nderungen wurden bez\u00fcglich \u00d6koeffizienz positiv reevaluiert. Die metabolische Flussanalyse zeigte NADH-Limitation in wachsenden Zellen. Das Testen einer Zitratzyklusregulationsmutante ergab vielversprechende Resultate wie die Reduzierung der Essigs\u00e4ureproduktion und die Erh\u00f6hung der Produktivit\u00e4t. Wasser einbauende Dehydrogenasen zeigten hohe Aktivit\u00e4ten in Ganzzellkatalysatoren. F\u00fcr 4-Hydroxychinaldin wurde ein vielversprechender Zweiphasenprozess entwickelt. Die stabile Emulsion konnte mit komprimiertem CO2 effizient gebrochen werden. Mit einer neu gebauten SFE\/SFC-Anlage konnte gezeigt werden, dass das Wertprodukt \u00fcber mehrere Trennstufen effizient extrahiert werden kann. Die interdisziplin\u00e4re Zusammenarbeit in diesem Projekt hat somit wichtige Erkenntnisse und Entwicklungen hin zu einer Technologieplattform f\u00fcr nachhaltige integrierte Bioprozesse erbracht.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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