Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Enzymatische Prozesse, insbesondere stereoselektive Hydrolysen und Synthesen gewinnen in der modernen Feinchemie st\u00e4ndig an Bedeutung. Enzymatische Reaktionen k\u00f6nnen im Vergleich zur chemischen Katalyse h\u00e4ufig unter milderen Bedingungen bez\u00fcglich der Verwendung von organischen L\u00f6sungsmitteln und solcher Prozessparameter wie Temperatur, Druck und pH-Wert durchgef\u00fchrt werden. Ein weiterer \u00f6kologischer Vorteil von Biokatalysatoren beruht auf der Eigenschaft der Enzyme, eine Vielzahl von Reaktionen stereo- und enantioselektiv zu katalysieren, sodass mehrstufige Synthesen mitunter verk\u00fcrzt, Ausbeuten gesteigert und Nebenprodukte minimiert werden k\u00f6nnen. Biokatalytische Prozesse haben also ein erhebliches Potenzial zur Ressourcenschonung und Umweltentlastung. Der erhebliche Zeitdruck (time to market) unter dem neue Prozesse etabliert werden m\u00fcssen, macht eine lang angelegte Suche nach dem geeigneten Enzym im Vorfeld der Prozessplanung unm\u00f6glich. Deshalb geht der Trend zur Vorhaltung einer Sammlung verschiedener Enzyme, die in einem durchmusterungsf\u00e4higen Format abgelegt sind. Diese Banken (Kits) lassen sich sehr schnell auf das Vorhandensein eines geeigneten Enzyms untersuchen. Die Nachfrage namhafter Industrieunternehmen nach neuen Esterasen\/Lipasen belegt, dass das vorhandene Angebot nicht ausreichend ist. Entsprechend ist es das Ziel des Verbundprojekts und insbesondere der BRAIN AG eine umfangreiche, hochdiverse und charakteri-sierte Enzymbank aufzubauen, um sich in diesem Marktsegment zu positionieren.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFolgende Methoden wurden von Projektpartner I angewendet: Amplifikation, Klonierung und Sequenzierung von Esterase-Genen, \u00dcberexpression von Esterase-Genen, Fermentation, Proteinanalytik, Proteinreinigung, Untersuchungen zur Enzymstabilit\u00e4t und Enzymcharakterisierung mittels spektrophotometrischer Tests. Bei Projektpartner II wurden folgende Arbeitsschritte durchgef\u00fchrt: Optimierung der Kultivie-rung der PLE in E. coli durch Chaperon-Coexpression, Identifizierung der Aminos\u00e4uresequenz der ?- und ?-Untereinheiten der PLE mittels MALDI-TOF-Massenspektrometrie, Identifizierung der Nukleotidse-quenz der ?- und ?-Untereinheiten der PLE mittels mRNA-Isolierung und cDNA-Synthese, Herstellung und Charakterisierung der PLE-Mutanten, Aktivit\u00e4ts-Screening von Enzymextrakten der Firma BRAIN mit Hilfe eines pH-Assays, enzymatische Hydrolyse industriell relevanter Esterverbindungen mit ausgew\u00e4hl-ten Enzymen, Entwicklung der Chiralanalytik (GC, HPLC). Die Aufgaben von Projektpartner III waren: Einordnung der Esterasesequenzen in die LED (lipase esterase database) mittels BLAST, Identifizierung m\u00f6glicher Template \u00fcber homologe Familien der LED, Erstellen von Homologiemodellen mit MODELLER \u00fcber Multisequenzalignment \u00fcber homologe Familien der LED, Bewertung der Homologiemodelle mit ProCheck und ProSa, Substrat-Dockung \u00fcber Kombination aus molekularem
\nDocking (FlexX) und molecular mechanics (Amber9).<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Projektteil Schweineleberesterase (PLE) wurden zun\u00e4chst durch MALDI-TOF-TOF-Analyse Unterschiede im Peptidspektrum der Isoenzyme festgestellt und daraus abgeleitete Aminos\u00e4ureaustausche in das Gen der -rPLE eingef\u00fchrt. Ausgew\u00e4hlte Varianten zeigten deutlich erh\u00f6hte Enantioselektivit\u00e4ten gegen\u00fcber ausgew\u00e4hlten Substraten im Vergleich zur -rPLE. Ausgehend von der mRNA aus Schweinele-ber gelang es nach Umschreibung in cDNA vier Klone zu identifizieren, die deutlich ver\u00e4nderte Sequen-zen (vier bis 21 Aminos\u00e4ureaustausche) als die -rPLE aufweisen. Alle Esterasevarianten wurden in E. coli Origami mit Chaperonen coexprimiert und biochemisch charakterisiert. Zwei Klone zeigen deutlich erh\u00f6hte bzw. umgekehrte Enantioselektivit\u00e4ten. Zus\u00e4tzlich wurden Protokolle zur Aufreinigung und Kris-tallisation der PLE entwickelt.
\nIm Projektteil rekombinante Herstellung und Charakterisierung von Esterasen\/Lipasen aus dem Metage-nom wurde f\u00fcr 13 priorisierte Enzyme die Klonierung bzw. Umklonierung des Gens und die \u00dcberexpression begonnen. 11 Kandidaten konnten \u00fcber Expressionsstudien im 200 ml Sch\u00fcttelkolben-Ma\u00dfstab und 1,5 l Fermentation bis in den 10 l Ma\u00dfstab gef\u00fchrt werden. Weitere Arbeiten befassten sich mit der Rei-nigung und Charakterisierung der Enzyme hinsichtlich Temperatur-Optimum sowie Thermo- und pH-Stabilit\u00e4t. Die von Projektpartner BRAIN zur Verf\u00fcgung gestellten 80 Esterasen und zwei Lipasen wurden vom Projektpartner TCB zun\u00e4chst mit einem Hochdurchsatz-Screening System unter Einsatz eines pH-Assays auf ihre Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber industriell-relevanten Substraten durchmustert. Die Stereoselektivit\u00e4t aktiver Enzyme wurde anschlie\u00dfend in Reaktionsans\u00e4tzen im Milligramm-Ma\u00dfstab unter Verwendung neu entwickelter Methoden zur GC-Separation der Enantiomere untersucht. Dabei wurden f\u00fcr die Hydrolyse von cis-3,5-Diacetoxycyclopent-1-en vier Biokatalysatoren identifiziert, die einen Enantiomeren\u00fcberschuss der Produkte von \u00fcber 96 %ee und einem Umsatz von bis zu 100 % erm\u00f6glichen, wobei drei En-zyme eine (-)-Pr\u00e4ferenz zeigten und eine Esterase bevorzugt das (+)-Enantiomer bildete. Dies konnte in pr\u00e4parativen Reaktionen best\u00e4tigt werden. Die erhaltenen optischen Reinheiten liegen deutlich \u00fcber den besten literaturbekannten Enzymen. Folglich belegen diese Ergebnisse die Bedeutung der Ressource des Metagenoms zur Identifizierung neuer und hochselektiver Biokatalysatoren.
\nIm Projektteil Modelling wurden Verbundpartner III 40 nicht-redundante Sequenzen f\u00fcr neue Esterasen \u00fcbermittelt, die der pr\u00e4diktiven Strukturanalyse durch Homologie-Modellierung und docking-Studien dienten. Die sequenzierten metagenomischen Esterasen wurden von Projektpartner III gegen die LED (lipase esterase database) geBLASTet und in homologe Familien eingeordnet. F\u00fcr 23 der 41 Ausgangssequenzen (56 %) lie\u00dfen sich Homologiemodelle erstellen. F\u00fcr die anderen 18 Sequenzen konnte kein ausreichend homologes Protein mit aufgekl\u00e4rter Struktur gefunden werden, um die Erstellung eines Homologiemodells zu erm\u00f6glichen. Von diesen 23 Homologiemodellen sind 11 von guter, 8 von m\u00e4\u00dfiger und 4 von schlechter Qualit\u00e4t. Anhand der 15 im Projektantrag beschriebenen sekund\u00e4ren und terti\u00e4ren Alkoholen, und der Carbons\u00e4uren wurden f\u00fcr die modellierten Enzyme mittels voll flexiblem Docking biochemische Profile erstellt. Im Lauf des Projekts wurden diese Profile um vier Substrate erweitert. Bei Vergleich von biochemischen Profilen guter Modelle mit experimentellen Daten vom Verbundpartner I konnte eine Korrelation von 75 % erreicht werden.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurde an einer Vielzahl von Fachvortr\u00e4gen auf nationalen und internationalen Kongressen und Messeveranstaltungen zur Verbreitung der Ergebnisse teilgenommen. Darunter sind z. B.: Biotechnika 2005 und 2007, Multi-Step Enzym Catalyzed Prozesses (MECP) 2006, Protein Design and Evolution for Biocatalysis 2006, Biosperspectives 2006 und 2007, German Conference on Bioinformatics 2006, der Besuch des Molecular Modelling Workshops und die Teilnahme an der 4th Oulu Sum-mer School in Bioprocess Engineering.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Projektverlauf wurden alle relevanten Methoden zur Erreichung eines wichtigen Ziels des Verbunds etabliert und erfolgreich angewendet: die rasche und zuverl\u00e4ssige Bereitstellung in Bezug auf Substrat-spektrum und Stereoselektivit\u00e4t charakterisierter Enzymbanken. Mit diesem Portfolio sollte eine Realisierung biokatalytischer Verfahren wesentlich vereinfacht sein, da sowohl die Identifizierung geeigneter En-zyme, die zudem rekombinant herstellbar sind, als auch Informationen zur Aktivit\u00e4t und Stereoselektivit\u00e4t verf\u00fcgbar sind.
\nF\u00fcr die Schweineleberesterase ist insbesondere durch die optimierte Expression ohne Bildung von inclusion bodies durch Chaperon-Coexpression mit einem Produktionsverfahrens zu rechnen sofern die Probleme in der Ma\u00dfstabsvergr\u00f6\u00dferung bei der Hochzelldichtekultivierung gel\u00f6st werden k\u00f6nnen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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