Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel dieses Projekts ist es, neue Enzyme bereitzustellen, die f\u00fcr eine biotechnologische Anwendung in der chemisch\/pharmazeutischen Industrie geeignet sind und zur Umweltentlastung beitragen. Der be-sondere Schwerpunkt des Projekts liegt dabei auf Decarboxylasen, die ohne Co-Enzym eine Decarboxy-lierung doppeltsubstituierter Malons\u00e4urederivate erm\u00f6glichen. Die Erschlie\u00dfung und Verwertung neuer Enzyme dieser Enzymklasse (EC 4.1.1.) ist als eine wichtige Alternative gegen\u00fcber dem chemischen Zugang zu einer Vielzahl an optisch aktiven ?-substituierten Carbons\u00e4uren anzusehen (Ohta, Adv. Bio-chem. Eng Biotechnol. 63, 1999, 1-20). Dar\u00fcber hinaus sollen neben den Malons\u00e4uredecarboxylasen zusammen mit der Degussa AG Aminos\u00e4uredecarboxylasen identifiziert und zu einer Verwertung gef\u00fchrt werden. Decarboxylasen sind begehrte Biokatalysatoren, da sie eine Vielzahl unterschiedlicher Reaktionen spezifisch (regio- und enantioselektiv) und mit einer hohen Umsatzzahl katalysieren k\u00f6nnen. Aus diesem Grund bietet sich ihr Einsatz in der chemischen Synthese an.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten Methoden-\tScreening einer Mutantenbank der Decarboxylase aus Bordetella bronchisepticus (AMDase)
\n–\tKlonierung von homologen Genen nach Datenbankvergleich
\n–\tAnreicherung von Umweltproben
\n–\tDetektion von aktiven Isolaten mit Hilfe eines pH-abh\u00e4ngigen Verfahrens<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Ziel des Projekts war die Isolierung und biochemische Charakterisierung von Co-Faktor-unabh\u00e4ngigen Arylmalons\u00e4ure-Decarboxlyasen und von ausgew\u00e4hlten Aminos\u00e4uredecarboxylasen. Zu Beginn des Projektes lag in den Datenbanken lediglich eine Co-Faktor-unabh\u00e4ngige Arylmalons\u00e4ure-Decarboxlyase vor (GB # 728844). Wir haben es in der relativ kurzen Projektlaufzeit geschafft zumindest einen weiteren Organismus zu identifizieren, bei dem eine Co-Faktor-unabh\u00e4ngige Decarboxylase vorliegt. Die Co-Faktorunabh\u00e4ngigkeit wurde in ersten Tests mit nativem Enzym verifiziert. Dar\u00fcber hinaus wurden vier weitere Organismen isoliert, die mit hoher Wahrscheinlichkeit \u00fcber derartige Enzyme verf\u00fcgen. Allerdings sind die gemessenen Aktivit\u00e4ten in diesen vier Organismen niedrig im Vergleich zu unserem ersten E-Isolat (Variovorax sp.HH01). \u00dcberraschend ist die extrem hohe Aktivit\u00e4t in den Rohextrakten des Variovorax-Isolats im Vergleich zu allen anderen Isolaten und im Vergleich zur bekannten Decarboxyla-se aus Bordetella (Alcaligenes) bronchisepticus. Aufgrund der hohen Aktivit\u00e4ten im Variovorax-Isolat wurde zun\u00e4chst damit begonnen, dieses Enzym zu charakterisieren. Diese Arbeiten sind jedoch auf-grund der nur geringen F\u00f6rdersumme, die dem Hamburger und J\u00fclicher Labor zur Verf\u00fcgung standen noch nicht zum Abschluss gekommen. Immerhin ist es aber gelungen, die korrespondierende DNA-Sequenz zu ermitteln und erste Versuche zur Expression in E. coli durchzuf\u00fchren. \u00c4hnlich positiv ist die Ergebnislage in Bezug auf die gefundenen Aminos\u00e4uredecarboxylasen zu beurteilen. Beide Enzyme liegen zudem bereits in rekombinanter Form vor. Von daher kann man davon ausgehen, dass eine \u00dcberexpression und biochemische Charakterisierung hier z\u00fcgiger voranschreiten wird als bei der ausgew\u00e4hlten AMDase. Ausgehend von diesen Arbeiten wird es das Ziel der weiteren Arbeiten sein, das jeweilige Protein rekombinant zu produzieren und eine Patentanmeldung bzw. Verwertung zu erreichen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Leggewie, C., Grooters, M., Kircher, M., Ayguen, H., Jaeger, K.-E., Streit, W.R. (2006): Isolation of novel decarboxylases for the production of double substituted acetic acid derivatives. Tagung Biocat, Hamburg, Germany, Posterpr\u00e4sentation
\nHorn, S, Leggewie, C., Grooters, M., Kircher, M., Ayguen, H., Jaeger, K.-E., Streit, W.R. (2006): Isolation of novel decarboxylases for the production of double substituted acetic acid derivatives. VAAM -Tagung 2007 und 2008
\nBiotechnica 2007
\nStreit, W.R.: Dechema Jahrestagung 2007, Wiesbaden. Vortrag<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Es ist uns gelungen, eine neue Aryl-Malons\u00e4uredecarboxylase zu identifizieren. Allein dies ist positiv zu werten, da es bisher nur einen Genbankeintrag f\u00fcr ein funktionales Enzym gibt. Dadurch ergeben sich jetzt neue M\u00f6glichkeiten in Bezug auf die Charakterisierung der Substratspezifit\u00e4ten und andere bio-technologisch wichtige Parameter dieser Enzymklasse. Auch die Arbeiten zu den Aminos\u00e4uredecarboxylasen wurden durch die Isolierung und teilweise biochemische Charakterisierung von zwei neuen Enzymen abgeschlossen. Alle Arbeiten werden im Rahmen von Diplomarbeiten und Dissertationen in den beiden Universit\u00e4tsgruppen weitergef\u00fchrt, um Decarboxylasen als Biokatalysatoren weiter zu erschlie\u00dfen und f\u00fcr biotechnologische Anwendungen nutzbar zu machen. Eine Patentierung der AMDase (AmdA) aus Variovorax sp. HH01 sowie des benachbarten Gens, der Racemase (AmdC), ist zudem in Vorbereitung. Allerdings fehlen hierzu noch einige biochemische Tests, die erst in den kommenden Monaten durchgef\u00fchrt werden k\u00f6nnen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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