Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Zur Gewinnung chiraler Bausteine werden heute \u00fcberwiegend chemisch katalysierte Reduktionen einge-setzt. Die technische Durchf\u00fchrung erfolgt in der Regel unter extremen, energieintensiven Reaktionsbedingungen, Einsatz giftiger und Umwelt belastender Schwermetallkatalysatoren und Verwendung gro\u00dfer Mengen organischer L\u00f6sungsmittel. Auf der anderen Seite zeigen einige Prozessbeispiele, dass die Biokatalyse unter \u00f6konomischen Gesichtspunkten mit der chemischen asymmetrischen Synthese durchaus konkurrieren und dabei \u00f6kologische Vorteile aufweisen kann. Besonders das Potential der B\u00e4ckerhefe zur stereoselektiven Reduktion vieler (strukturell einfacher) prochiraler Ketone ist auch im pr\u00e4parativen Ma\u00dfstab gut dokumentiert. Zur effektiveren Durchf\u00fchrung von Hefereduktionen wurde daher ein rekombinanter Hefestamm entwickelt (Coexpression einer Carbonylreduktase und eines Cofaktor-Regenerierungsenzyms). Im Vergleich zu Wildtyp-Zellen konnten damit Biotransformationsgeschwindigkeiten und Ausbeuten effektiv gesteigert werden. Allerdings zeigte sich, dass die erzielbaren Enantioselektivit\u00e4ten sehr von den Kultivierungsbedingungen bei der Herstellung des Biokatalysators abh\u00e4ngen.
\nZielsetzung dieses Forschungs- und Entwicklungsvorhabens ist daher die Entwicklung eines effektiven Produktionsverfahrens zur Herstellung von rekombinanten B\u00e4ckerhefen f\u00fcr enantioselektive Reduktionen. Prozessbeispiel ist die asymmetrische Reduktion von 4-Cl-Acetessigs\u00e4ureethylester (4Cl-ACE) zu (S)-4-Cl-3-Hydroxy-Butters\u00e4ureethylester (S-CHBE). S-CHBE mit einem Marktvolumen von mehreren 100 jato wird industriell zur Synthese von Cholesterinsenkern eingesetzt. Da zur Optimierung der Herstellung dieses Biokatalysators zahlreiche Experimente im pH-kontrollierten R\u00fchrkesselreaktor erforderlich sind, soll eine neue Paralleltechnik weiterentwickelt und eingesetzt werden, die es erlaubt, bis zu 48 pH-kontrollierte Fedbatch-Experimente in parallelen<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIm Einzelnen sollen f\u00fcr einen Bioreaktorblock mit 48 R\u00fchrkesselreaktoren eine parallele pH-Kontrolle, ei-ne parallele Drehzahl\u00fcberwachung und eine parallele Tr\u00fcbungsmessung entwickelt werden. Diese weiterentwickelte neue Paralleltechnik soll zur parallelen Optimierung von rekombinanten Hefezellen f\u00fcr Bioreduktionen genutzt werden. Hierzu soll der Laborprozess zun\u00e4chst in den 10 mL-Ma\u00dfstab \u00fcbertragen werden. Danach soll eine parallele Optimierung der Biokatalysator-Herstellung im pH-kontrollierten Zu-laufverfahren im 10 mL-Ma\u00dfstab erfolgen. Abschlie\u00dfend soll die enantioselektive Reduktion von 4Cl-ACE zu S-CHBE mit optimal hergestellten rek. Saccharomyces cerevisae ma\u00dfstabsvergr\u00f6\u00dfert werden.
\nProjektpartner des Lehrstuhls f\u00fcr Bioverfahrenstechnik der Technischen Universit\u00e4t M\u00fcnchen sind die Firmen H+P-Labortechnik AG (Bioreaktorblock \/ Drehzahl\u00fcberwachung), Precision Sensing GmbH (opti-sche Sensorik \/ Tr\u00fcbungsmessung), DASGIP AG (parallele Prozessleittechnik) und Consortium f\u00fcr elekt-rochemische Industrie GmbH (rekombinante Hefe f\u00fcr Bioreduktionen \/ Ma\u00dfstabsvergr\u00f6\u00dferung).<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Parallele Optosensorik: Es wurden 6 \u0082Sensorst\u00e4be mit neuen optischen Komponenten zur optosensorischen pH- und pO2-Kontrolle entwickelt und bereitgestellt. Die optischen pH-Sensoren wurden durch Ver\u00e4nderung der Sensormatrix (Festladungsdichte, Hydrophilie) und durch Einbringung von wei\u00dfen, reflektierenden Nanopartikeln so weit verbessert, dass die Ionenst\u00e4rke des Reaktionsmediums keine Rolle mehr spielt und die Lichtst\u00e4rke stark erh\u00f6ht wurde. Durch die neuen optischen Komponenten im \u0082Sensorstab und die Ver\u00e4nderungen im Sensoraufbau konnte erstmalig eine von St\u00f6reinfl\u00fcssen unabh\u00e4ngige optische pH-Messung realisiert werden. Dies konnte auch bei der Kultivierung von Saccharomyces cere-visiae in Milliliter-Bioreaktoren best\u00e4tigt werden. In der Praxis funktionierte die Optosensorik zur online Messung des pH und pO2 in verschiedenen Kultivierungen sehr zufrieden stellend. Die typischen Abweichungen des pH liegen im Bereich von bis zu 0,2 pH-Einheiten sowie 5 – 10 % Lufts\u00e4ttigung f\u00fcr den pO2.<\/p>\n
Parallele pH-Regelung: Zur Entwicklung eines parameteradaptiven pH-Reglers wurden die wesentlichen regelungstechnischen Eigenschaften der parallelen pH-Kontrolle von Bioprozessen im Bioreakti-onsblock zugrunde gelegt: Zyklische Abtastzeit der pH-Sensorik von 2 Minuten; Roboterstellglied mit stochastischer Abtastzeit von bis zu 10 Minuten. Durch Simulationsstudien mit nichtlinearer Modellierung der Hefekultivierung und Ber\u00fccksichtigung des Pufferverhaltens des Reaktionsmediums wurde eine generali-sierbare Strategie zur Parameteradaption entwickelt. Zentrale Kenngr\u00f6\u00dfe zur Parameteradaption ist das Verh\u00e4ltnis von zudosierter Korrekturmittelmenge\/pH-\u00c4nderung in einem (stochastischen) Abtastintervall des Roboterstellgliedes. Der entwickelte parameteradaptive Regler wurde in das Prozessleitsystem implementiert und experimentell verifiziert. Zusammenfassend konnte mit der vorgestellten Reglerimplemen-tierung und den verschiedenen Modifikationen ein robust arbeitender Regler erarbeitet werden, der in zahlreichen Parallelfermentationen einen geregelten pH bei optimiertem S\u00e4ure- und Laugenverbrauch sichergestellt hat.<\/p>\n
Parallele Drehzahl\u00fcberwachung: Es wurden Hallelement-Messplatten entwickelt und in den magnetisch-induktiven Bioreaktionsblock integriert. Die Position und Orientierung der Hallelemente konnte so gew\u00e4hlt werden, dass das magnetische Erregerfeld des Induktivantriebs weitestgehend unterdr\u00fcckt wur-de, das \u00fcberlagerte Feld des Dauermagneten im R\u00fchrorgan jedoch zu einem Messsignal mit ausreichend hoher Amplitude f\u00fchrte. Damit wurde es m\u00f6glich, den Ausfall eines, mehrerer oder aller 48 Magnetr\u00fchrer sicher zu detektieren. In das Prozessleitsystem wurden verschiedene Methoden zur rechtzeitigen Erkennung der Gefahr eines R\u00fchrerausfalls und zur pr\u00e4ventiven automatischen Reduktion der R\u00fchrerdrehzahl implementiert. Auch bei der parallelen Kultivierung von Saccharomyces cerevisiae konnte mit diesen Verfahren ein 100 % ausfallfreier Betrieb \u00fcber den jeweiligen Beobachtungszeitraum (von bis zu 3 Tagen) best\u00e4tigt werden. <\/p>\n
Parallele Tr\u00fcbungsmessung: Mit einem ersten Versuchsaufbau zur Tr\u00fcbungsmessung gelang der prinzipielle Nachweis, dass eine Messeinheit ohne zus\u00e4tzliche optische Komponenten, also alleine mit den 3 vorhandenen LEDs (rot, blau, gr\u00fcn) und den beiden Fotodioden zur pH- und pO2-Messung, f\u00fcr eine re-flektionsspektroskopische Messung einsetzbar ist. <\/p>\n
Ma\u00dfstabsverkleinerung Biokatalysatorherstellung: Das Satzverfahren zur Herstellung rek. Saccharomyces cerevisiae Biokatalysatoren konnte mit einer parallelen Reproduzierbarkeit von 10 % (Standardabweichung Biotrockenmassekonzentration) in den Milliliterma\u00dfstab \u00fcbertragen werden. Der Prozessverlauf entspricht im Rahmen der Beobachtungsgenauigkeit exakt dem Literma\u00dfstab.<\/p>\n
Ma\u00dfstabsverkleinerung Biokatalyse: Die Ganzzell-Biokatalyse mit rek. Saccharomyces cerevisiae und die parallele Probenaufbereitung f\u00fcr die GC-Analytik wurden miniaturisiert, parallelisiert und mit dem Laborroboter automatisiert. Das gesamte Verfahren ist in \u0082deep-well Mikrotiterplatten durchf\u00fchrbar, wobei allen Phasentrennungen (Zellabtrennungen, Phasentrennungen organisch \/ w\u00e4ssrig) direkt in der Mikroti-terplatte in einer Zentrifuge durchgef\u00fchrt werden k\u00f6nnen.<\/p>\n
Parallele Prozessoptimierung zur Herstellung von rek. Saccharomyces cerevisiae: Die parallele Optimierung der Biokatalysator-Herstellung f\u00fcr asymmetrische Synthesen ist im pH-kontrollierten Satzverfahren im 10 Milliliter-Ma\u00dfstab mit Hilfe einer neuartigen stochastischen Suchstrategie erfolgt. Hierbei konnten mit 7 Parallelexperimenten die Biotrockenmassekonzentration von 20 g L-1 auf \u00fcber 35 g L-1 und die S-CHBE-Konzentration von 90 mM auf 125 mM gesteigert werden. Allerdings zeigte sich auch, dass kein Reaktionsmedium gefunden werden konnte, bei dem alle 3 Zielgr\u00f6\u00dfen gleichzeitig maximiert waren: Ein hoher S-Enantiomeren\u00fcberschu\u00df von \u00fcber 99 % war nur bei niedrigen Produktkonzentrationen von unter 20 mM S-CHBE m\u00f6glich. Nachfolgend konnte eine ausgew\u00e4hlte enantioselektive Reduktion von 4Cl-ACE zu S-CHBE mit optimal hergestellten rek. Saccharomyces cerevisae exemplarisch in den 23 Li-ter Ma\u00dfstab \u00fcbertragen werden. <\/p>\n
Vergleichende \u00f6konomische und \u00f6kologische Bilanzierung: In Zusammenarbeit mit der DECHEMA wurde eine vergleichende \u00f6konomische und \u00f6kologische Bilanzierung des optimierten Hefeverfahrens, eines Lactobacillus Verfahrens (TUM) und eines industriellen Biohydrierungsverfahrens mit rek. Escherichia coli (Kaneka, Japan) zur Herstellung von S-CHBE ausgehend von 4Cl-ACE unter Verwendung der \u00df-Version der Software Sabento durchgef\u00fchrt. Hiermit wurde gesch\u00e4tzt, das der betrachtete Saccharo-myces-Prozess mit 153 \u0080\/kg S-CHBE den geringsten Gewinn im Vergleich zu 182 \u0080\/kg S-CHBE beim L. kefir-Prozess oder 202 \u0080\/kg S-CHBE beim E. coli – Prozess erwirtschaften w\u00fcrde. Bei diesem Vergleich von Biohydrierungsverfahren f\u00fchrt eine bessere Wirtschaftlichkeit auch zu einem geringeren Umweltwirkungspotential.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Weuster-Botz D, Puskeiler R, Kusterer A, Kaufmann K, John G, Arnold M (2004): Methods and devices for high-throughput bioprocess design (HTBD). Vortrag Internationaler Informationstag Mikro-Bioverfahrenstechnik der DECHEMA, Frankfurt, 11.11.2004.
\n\tKusterer A, Kaufmann K, Weuster-Botz D (2005): Parallele Kultivierung von Escherichia coli im Bioreaktorblock. GIT 4\/2005: 308-309.
\n\tWeuster-Botz D, Puskeiler R, Kusterer A, Kaufmann K, John G, Arnold M (2005): Methods and milliliter scale devices for high-throughput bioprocess design. Bioproc Biosys Eng 28: 109-119.
\n\tWeuster-Botz D, Puskeiler R, Kusterer A, Kaufmann K, John G, Arnold M (2005): High-throughput bio-process design. Vortrag Forum Life Science 2005, Garching, 16.-17.02.2005.
\n\tWeuster-Botz D (2005): High-throughput bioprcess design for a faster time to market. Interview in: Etterer T, Konrad M, Nassauer J: Bayern Innovativ Special Report Forum Life Science 2005: Bioengi-neering.
\n\tWeuster-Botz D, Puskeiler R, Kusterer A, Kaufmann K, John GT, Arnold M (2005): Parallel bioreactors on a milliliter-scale for high-throughput bioprocess design. Poster Biochemical Engineering XIV, July 10-14, 2005, Harrison Hot Springs, BC, Canada.
\n\tWeuster-Botz D, Kusterer A, Kaufmann K, John GT, Arnold M: Personal Biotechnikum. Exponat Forum Life Science 2005, Garching, 16.-17.02.2005.
\n\tArnold M: High Throughput Bioprocess System. Exponat auf dem Messestand der DASGIP AG, BioTechnica 2005 (Hannover)
\n\tWeuster-Botz D (2006): Mikro-Bioverfahrenstechnik. Chem Ing Tech 78: 256-260.
\n\tA. Kusterer, K. Kaufmann, Ch. Krause, M. Arnold, D. Weuster-Botz: Automation of Disposable Stirred-Tank Bioreactors. Vortrag GVC\/DECHEMA Jahrestagungen 2006 mit 24. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, Wiesbaden, 26.-28.09.2006.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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