Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Das Projektziel umfasste die Entwicklung eines umweltfreundlichen elektroenzymatischen Verfahrens zur Herstellung verschiedener chiraler Epoxide und Ketone mit hoher Enantiomerenreinheit mittels kofaktorabh\u00e4ngigen Biokatalysatoren. Um dieses Ziel zu realisieren, sollten bekannte Katalysatoren m\u00f6glichste einfach hergestellt werden, um als Shelf-Enzyme zur Verf\u00fcgung zu stehen. Au\u00dferdem sollten mit Hilfe neuer Screeningsysteme weitere Oxygenaseaktivit\u00e4ten aus Umweltproben isoliert werden. Durch die Kombination von in silico und in vitro Methoden sollten die Katalysatoren in Ihrer Aktivit\u00e4t und Spezifit\u00e4t verbessert werden, um f\u00fcr die Anwendung interessant zu sein.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenMethodisch erstreckten sich die Arbeitsschritte vom Durchsuchen nat\u00fcrlicher Diversit\u00e4t bis zur optimierten Prozessentwicklung. Konzeptionell war wichtig, dass entlang der industriellen Verwertungskette neue Katalysatoren aus der Biodiversit\u00e4t f\u00fcr die Entwicklung von Epoxygenierungs-\/Hydroxylierungsprozessen gesucht, und insbesondere die industriell bedeutsame Enzymklasse der Epoxygenasen f\u00fcr Methoden der gelenkten Evolution zug\u00e4nglich gemacht wurden. Gleichzeitig wurde die elektrochemische Prozesstech-nologie weiterentwickelt, um eine rasche Nutzung\/Verwertung der aufgefundenen Aktivit\u00e4ten in neuen nachhaltigen Prozessen zu gew\u00e4hrleisten. Im Einzelnen wurden folgende verzahnte Arbeitspakte definiert:
\nA)\tEntwicklung von Screeningsystemen zum Auffinden neuer Monooxygenasen f\u00fcr Hydroxylierung und Epoxydierungsreaktionen an Substraten, die von der BASF AG benannt wurden und industriell bedeutsam sind.
\nB)\tScreening und Bereitstellung neuer Monooxygenasen aus kultivierbarer Biodiversit\u00e4t
\nC)\tIdentifikation und Isolierung der Volll\u00e4ngen-Gene neuer Monooxygenasen und heterologe Darstellung der Enzyme, sowie Herstellung genomischer Genbanken und Bereitstellung von Metagenom-Genbanken aus nicht-kultivierter Biodiversit\u00e4t f\u00fcr ein hochdurchsatzf\u00e4higes Monooxygenase-Screening.
\nD)\tEntwicklung eines FACS-Nachweissystems zum Durchmustern von Metagenomen.
\nE)\tProzessentwicklung mit der Styrolepoxygenase StyAB und der thermostabilen Alkoholdehydrogenase TADH: Evaluierung des elektrochemischen Prozesses, Optimierung des Expressionssystem und gerichtete Evolution der Styrolepoxygenase.
\nF)\tErstellung eines Strukturmodells der TADH basierend auf einer Strukturdatenbank aller bekannter Alkoholdehydrogenasen. Darauf basierend in silico Vorhersagen \u00fcber Mutationsans\u00e4tze, um Substratspezifit\u00e4ten des Katalysators zu ver\u00e4ndern.
\nG)\tUmsetzung der in silico Vorschl\u00e4ge und Anwendung des mutierten Katalysators auf, aus pharmazeutischer Sicht interessante, Substanzbibliotheken im elektroenzymatischen Reaktor.
\nF)\tUmweltevaluation des verbesserten Prozesses am Beispiel der Styrolmonooxygnease.
\nUm diese Ziele zu erreichen, wurden komplement\u00e4re Ans\u00e4tze in zwei getrennten Modulen bearbeitet. In dem Modul Biooxidation lag der Schwerpunkt auf der Suche nach neuen Oxygenasen. Ferner wurden Katalysatoren technisch gereinigt, als Pulver f\u00fcr Prozessanwendungen bereitgestellt und mittels eines neuen Mutageneseverfahrens (SeSaM) evolviert.
\nDas Modul Bioreduktionen versuchte eine in silico Anpassung von enzymatischen Hydrierungskatalysatoren zur Umsetzung verschiedener Wirkstoffklassen. Aufbauend auf einer Datenbank homologer Proteine wurde ein Modell der Bindungstasche und des Katalysators entwickelt, welches basierend auf Vorhersagen von Substratspezifit\u00e4ten rationale Mutationen erm\u00f6glichen sollte. Die Vorhersagen wurden im Labor verifiziert und die Ergebnisse dem Modell wieder zugef\u00fchrt.
\nBiokatalysatoren aus beiden Modulen wurden in einem neu zu entwickelnden umweltfreundlichen elektroenzymatischen Reaktor, zur Herstellung verschiedener chiraler Epoxide und Alkohole\/Ketone eingesetzt.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Modul 1 Biooxidationen- Screeningsysteme zum Auffinden neuer Monooxygenasen f\u00fcr Hydroxylierungs- und Epoxydierungsreaktionen wurden erfolgreich entwickelt, validiert und zur BRAIN AG transferiert. F\u00fcr die benannten Substrate und Substratklassen wurden Durchmusterungssysteme zun\u00e4chst im 96-Well-Mikrotiterplatten entwickelt und publiziert (siehe Zwischenbericht).
\nAus der Stammsammlung der BRAIN AG und unterschiedlichster Umweltproben konnten so etwa 100 St\u00e4mme isoliert werden, die auf interessanten Kohlenwasserstoff-Verbindungen wachsen. Zur Identifikation und Isolierung der Volll\u00e4ngen-Gene neuer Monooxygenasen und der heterologen Darstellung der Enzyme wurde eine Genbank vom Isolat HD1106 erstellt. F\u00fcr das Durchmustern der Metagenombank ist ein Assay in der Entwicklung, welcher auf Doppelemulsionen basiert, die in einem FACS sortiert werden. Diese Arbeiten werden Mitte Mai abgeschlossen sein.
\nAu\u00dferdem wurde ein Nachweissystem f\u00fcr Aromatenhydroxylierungen auf der Basis von 4-Aminoantipyrin auf unsere Anwendung adaptiert[9]. Beim Durchmustern von S\u00e4ttigungsmutantenbibliotheken der Monooxygenase P450 BM3 wurden Varianten mit 8-fach erh\u00f6hter Aktivit\u00e4t f\u00fcr Phenoxytoluol aufgefunden[7]. Das Epoxidnachweissystem wurde f\u00fcr die Styrolmonooxygenase StyAB optimiert und in einer ersten Runde der Gelenkten Evolution wurden drei Klone isoliert, die nach wiederholtem Durchmus-tern im Rohextrakt eine ca. zweifach erh\u00f6hte Aktivit\u00e4t zeigten.
\nDer elektroenzymatische Prozess mit der Styrolmonooxygenase als Modellenzym wurde detailliert evaluiert und die grundlegenden Limitationen des Systems identifiziert. Es konnte gezeigt werden, dass die Regeneration des Kofaktors FAD zum FADH2 hochspezifisch abl\u00e4uft. Die Hauptproblematik in diesem System besteht im sogenannten Sauerstoffdilemma. Da bedingt durch die Reaktion es nicht in Frage kam, unter anaeroben Bedingungen zu arbeiten, wurde als Alternative ein artifizielles sauerstofftolerantes Deazaflavin synthetisiert und unter unseren Prozessbedingungen getestet. Leider konnte keine nennenswerte Aktivit\u00e4t mit diesen Kofaktor erzielt werden, weshalb nun haupts\u00e4chlich an prozesstechnischen L\u00f6sungen gearbeitet wird.
\nModul 2 Bioreduktionen- Um ein Strukturmodell der Alkoholdehydrogenase TADH zu erstellen wurde zun\u00e4chst eine umfangreiche Datenbank aufgebaut, welche alle zur TADH homologen Proteine enth\u00e4lt. Die Datenbank enth\u00e4lt zum gegenw\u00e4rtigen Zeitpunkt 7500 Sequenzeintr\u00e4ge von \u00fcber 3000 Proteinen. Basierend auf dieser Datenbank konnte ein Modell der Bindetasche von TADH konstruiert werden und in silico Vorschl\u00e4ge f\u00fcr gezielte Mutationen zur Ver\u00e4nderung der Substratspezifit\u00e4t gemacht werden. Parallel wurde eine einfache Ein-Schritt-Reinigung mit anschlie\u00dfender Lyophilisierung f\u00fcr technisch reine TADH entwickelt. Somit kann nun 8200 U TADH (85% rein) innerhalb von zwei Tagen zur Verf\u00fcgung gestellt werden. Die vorgeschlagenen Mutationen wurden technisch umgesetzt und in vitro charakterisiert. Dazu wurde eine erste Auswahl an speziellen Substraten, welche pharamazeutisch von Interesse sind, von der EMC-GmbH synthetisiert und auf Ums\u00e4tze getestet. Die in silico Vorhersagen konnten f\u00fcr einige Mutationen best\u00e4tigt werden. Um den elektroenzymatischen Prozess voranzubringen wurde eine kontinuierliche Durchflusszelle entwickelt. Ein neues Elektrodenmaterial erm\u00f6glichte eine Erh\u00f6hung der Kofaktorregenerationsrate um Faktor 20. Au\u00dferdem wurden unterschiedliche Ans\u00e4tze verfolgt, um eine Inaktivierung des Biokatalysators im elektroenzymatischen Prozess zu vermeiden. Es wurde sowohl versucht, die Oberfl\u00e4che des Enzyms chemisch zu modifizieren, als auch prozesstechnische L\u00f6sungen zu finden. W\u00e4hrend die chemischen Modifikationen nicht besonders erfolgreich waren, konnte durch eine Optimierung der Prozessbedingungen die Stabilit\u00e4t des Biokatalysators auf > 7 Tage unter Prozessbedingungen verbessert werden.
\nWirtschaftlichkeitsbetrachtung & Umweltevaluation- Eine abschlie\u00dfende Wirtschaftlichkeits- und Umweltbetrachtung des elektroenzymatischen Prozess ergab, dass im Falle der Oxidation die wirtschaftlichen Bedingungen noch nicht erf\u00fcllt sind. Die Aktivit\u00e4t der Monooxygenasereaktion ist viel zu gering, um wirtschaftlich interessant zu sein. Dies spiegelt sich auch in der Umweltevaluation wider, die f\u00fcr den Bio-prozess aufgrund der hohen Spezifit\u00e4t und der milden Reaktionsbedingungen zwar sehr positiv ausf\u00e4llt, allerdings von der Produktivit\u00e4t die Anforderungen nicht erreicht. Eine Evaluation anderer Prozesse, welche ebenfalls auf elektroenzymatischer Kofaktorregeneration basieren ergab, dass es derzeit keine Monooxygenase-Reaktion gibt, die die wirtschaftlichen Anforderungen soweit erf\u00fcllt, dass sie f\u00fcr eine Anwendung interessant sein k\u00f6nnte. Anders sieht es mit der Dehydrogenase-Reaktion aus. Hier ist es im Rahmen dieses Projekts gelungen, den Prozess entscheidend zu verbessern. Enzymstabilit\u00e4t und Produktivit\u00e4t konnten soweit erh\u00f6ht werden, dass dieser Prozess nun im Rahmen industriell interessanter Reaktionen liegt.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Sensitive assay for laboratory evolution of hydroxylases toward aromatic and heterocyclic compounds. Wong, T. S., Wu, N., Roccatano, D., Zacharias, M., Schwaneberg, U. (2005) Journal of Biomolecular Screening 10:246-252. (Titelseite)
\nA screening system for directed evolution of epoxygenases: validation reveals importance of position 184 in P450 BM3 for stereoselective styrene epoxydation. K.-L. Tee, U. Schwaneberg (2006) Angewandte Chemie, 45: 5380-5383.
\nA host\/guest complex enables directed evolution of a two-component epoxygenase (StyAB) for styrene epoxidation, Tee, K. L., Dmytrenkoa, O., Otto, K., Schmid, A., Schwaneberg, U., (zur Publikation eingereicht)
\nProductivity of electroenzymatic reduction and oxidation reactions: theoretical and practical considerations. R. Ruinatscha, V. H\u00f6llrigl, K. Otto and A. Schmid (2006) Advanced Synthesis & Catalysis 348:2015-2026
\nElectroenzymatic asymmetric reduction of rac-3-methylcyclohexanone to (1S,3S)-3-methylcyclohexanol in organic\/aqueous media catalyzed by a thermophilic alcohol dehydrogenase. V. H\u00f6llrigl, K. Otto, A. Schmid (2007) Advanced Synthesis & Catalysis (Accepted)<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Dieses sehr ehrgeizige und vielschichtige Projekt ist ein Beispiel f\u00fcr erfolgreiche interdisziplin\u00e4re Zusammenarbeit. An den Hochschulen entwickelte Methoden wie z. B. der Epoxidscreen konnten direkt beim KMU Partner implementiert werden. Als sehr interessant und vielversprechend hat sich die Kombination von in situ und in vitro Charakterisierung in Verbindung mit der Produktion von pharmazeutisch interessanten Ausgangsstoffen erwiesen. Etwas ern\u00fcchternd ist die Bilanz bei der Entwicklung eines elektrochemischen Prozesses f\u00fcr eine Anwendung mit einer Monooxygenase. Das Sauerstoffdilemma konnte nur bedingt gel\u00f6st werden und auch die Evolvierung des Enzyms brachte keine wesentliche Verbesserung des Prozesses. Die Anwendung der Elektroenzymologie auf sauerstoffunabh\u00e4ngige Reaktionen hingegen, wurde entscheidend vorangebracht und sollte unbedingt weiterverfolgt werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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