Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
In diesem Projekt sollen neue M\u00f6glichkeiten zur Bereitstellung von Proteinchips f\u00fcr Diagnostik und Proteinscreening dargestellt werden. Das Ziel ist es, zu zeigen, dass Aptamere, die verschiedene relevante Zielmolek\u00fcle hochspezifisch und hoch affin in L\u00f6sung binden k\u00f6nnen, auf Chipoberfl\u00e4chen \u00fcber robuste und universell anwendbare Methoden kovalent und gezielt gekoppelt werden k\u00f6nnen, dabei ihre Bin-dungseigenschaften beibehalten und f\u00fcr eine schnelle Proteinanalytik einsetzbar sind.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIn den modernen Biowissenschaften besteht ein steigender Bedarf nach Hochdurchsatzmethoden, die eine schnelle, direkte und quantitative Bestimmung von Proteinen erm\u00f6glichen. Die Entwicklung geeigneter Techniken, insbesondere von Protein-Microarrays ist jedoch mit Schwierigkeiten verbunden, die insbesondere mit der Diversit\u00e4t der Proteine zusammenh\u00e4ngen. Aufgrund dieser Nachteile haben sich die Antragsteller das Ziel gesetzt, die Wechselwirkung zwischen Aptameren und Proteinen f\u00fcr die Protein-Mikroarray-Technologie auszunutzen. Aptamere sind hoch affine Nukleins\u00e4uren, die an ihre Targetstruktur mit gro\u00dfer Spezifit\u00e4t und St\u00e4rke binden, dabei aber durch ihre biochemische Struktur biologisch abbaubare, nicht toxische Substanzen darstellen. Sie sind ausgezeichnete umweltentlastende und ressourcenschonende hochspezifische Erkennungsmolek\u00fcle. Im Projekt werden von der RiNA GmbH zwei bereits entwickelte Aptamere hergestellt und zwei neue Aptamere (gegen Insulin und His-tags) entwickelt und zur Verf\u00fcgung gestellt. Im TCI werden diese vier Aptamersysteme dann zur Herstellung und Testung von Proteinchips (im Vergleich zu konventionellen Antik\u00f6rperchips) verwendet. Vivascience ist der Partner in der Chipentwicklung (Membranen, Membranchemie) und der Testkit Entwicklung. In allen Projektstufen ist eine klare Abstimmung unter allen Partnern gew\u00e4hrleistet. Die His-getagten Enzyme (Esterasen und eine Alkoholdehydrogenase) werden vom AK Prof. Bornscheuer hergestellt und zur Verf\u00fcgung gestellt. In Zusammenarbeit mit der DECHEMA wird eine \u00f6kologische Bewertung der Testsysteme f\u00fcr das Screening im Produktionsbereich vorgenommen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Rahmen der durchgef\u00fchrten Arbeiten konnte die Eignung von Aptameren zur Detektion von Proteinen mittels Microarray-Technologie demonstriert werden. Es wurden diverse Versuche zur Funktionalisierung des Microarray-Substrates und Bindungsstudien zwischen Aptamer und Zielmolek\u00fcl durchgef\u00fchrt. Ausgehend von aminomodifizierten Oberfl\u00e4chen wurde eine Methode zur Immobilisierung des Aptamers nach Aktivierung mit Cyanurchlorid entwickelt. Zus\u00e4tzlich wurde eine mit Polyethylenimin modifizierte Oberfl\u00e4che bereitgestellt, die sterische Hinderungen bei der Faltung des Aptamers minimiert. Bei den Hybridisierungsexperimenten erwies sich sowohl die verwendete Oberfl\u00e4che als auch die Orientierung des Aptamers auf der Oberfl\u00e4che von entscheidender Bedeutung f\u00fcr den Erhalt der Funktion des immobilisierten Aptamers. Der aptamerbasierte Microarray wurde optimiert und ein Protokoll zur Durchf\u00fchrung der Microarray-Experimente entwickelt. Die universelle Anwendbarkeit der Oberfl\u00e4chen und des Protokolls wurden durch Versuche mit vier verschiedenen Aptameren best\u00e4tigt. Dabei wurden zwei gegen den His-Tag gerichtete Aptamere, ein Aptamer gegen Streptavidin sowie ein Aptamer gegen Daunorubicin verwendet. Somit wurde ein universelles Aptamer-Microarray Testkit geschaffen, mit dem Aptamere unabh\u00e4ngig von ihren Selektionsbedingungen zur Detektion von Proteinen und anderen Substanzen \u00fcber Microarrays genutzt werden k\u00f6nnen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Folgende Beitr\u00e4ge wurden ver\u00f6ffentlicht: 15th Annual Meeting of the German Society for Cytometry 2005: DNA and protein arrays in biotechnology (Vortrag); Statusseminar Chiptechnologien 2007: Entwicklung von aptamerbasierten Protein Microarrays f\u00fcr biotechnologische Anwendungen; BioPerspectives 2007: Aptamers: Alternative Capture Molecules applied to Protein Microarrays sowie zwei Artikel: Nonradioactive fluorescence microtiter plate assay monitoring aptamer selections, Biotechniques, 42 (2007), 578-582 und Semiautomated selection of DNA aptamers using magnetic particle handling Biotechniques, 43 (2007), 344-353. Auf dem Statusseminar Chiptechnologien 2008 wurde folgender Beitrag eingereicht: Application of Aptamers to Protein Microarrays: Systematic Investigation of Immobilization Strategies
\nWeitere Ver\u00f6ffentlichungen sind in Vorbereitung.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die wissenschaftlichen Arbeiten innerhalb des Projekts sind abgeschlossen. Die Bereitstellung geeigneter modifizierter Oberfl\u00e4chen sowie Studien zur Immobilisierung verschiedener Aptamere konnten erfolgreich abgeschlossen werden. Es wurden aptamerbasierte Microarrays zur Detektion von His-getagten Proteinen, Streptavidin sowie Daunomycin entwickelt. Dabei konnten medizinisch relevante Konzentrationen detektiert werden<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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