Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Biokatalysatoren – Enzyme oder Mikroorganismen – werden in der Zukunft eine Schl\u00fcsselrolle bei der Herstellung wertvoller Verbindungen f\u00fcr die chemische und pharmazeutische Industrie spielen. Insbesondere bei der Synthese chiraler Verbindungen haben Biokatalysatoren ein gro\u00dfes Potenzial. Im Sinne einer integrierten Produktionsweise ist daher die biokatalytische Synthese von enantiomerenreinen Wirkstoffen von Vorteil, weil nur so die kostenintensive Enantiomerentrennung vermieden werden kann. Ziel des vorliegenden Vorhabens war die umweltfreundliche Gewinnung von Amino- und Carbons\u00e4uren aus Amiden durch den Einsatz neu entdeckter Amidasen aus extremophilen Mikroorganismen. Im Gegensatz zu den bereits beschriebenen Amidasen zeichnen sich die Enzyme aus extremophilen Mikroorganismen durch eine hohe Stabilit\u00e4t gegen\u00fcber hohen Temperaturen und anderen denaturierenden Einfl\u00fcssen aus. Dar\u00fcber hinaus verf\u00fcgen die neu entdeckten Amidasen \u00fcber breite pH-Spektren, die insbesondere auch den sauren und neutralen Bereich abdecken.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIm Rahmen des Projekts wurden zwei Amidasen aus thermophilen Actinomyceten aufgereinigt und vollst\u00e4ndig charakterisiert. Die Enzyme aus Thermocrispum municipale 4K und Pseudonocardia thermophila zeichnen sich durch hohe Thermoaktivit\u00e4t und -stabilit\u00e4t aus und verf\u00fcgen \u00fcber ein breites Substratspektrum. Diese Eigenschaften machen sie interessant f\u00fcr eine industrielle Anwendung. Im Rahmen der molekularbiologischen Arbeiten in diesem Projekt konnte die Gensequenz der Amidase aus Pseudonocardia thermophila aufgekl\u00e4rt werden. Dar\u00fcber hinaus wurden weitere Amidasegene aus extremophilen Mikroorganismen kloniert und in mesophilen Wirtszellen exprimiert.
\nMethoden:
\no\taerobe Kultivierungstechnik
\no\tProteinaufreinigung mittels verschiedener chromatographischer Methoden
\no\tHPLC-Untersuchungen zur Charakterisierung von Enzymen
\no\tIsolierung der genomischen DNA mittels CTAB-Methode
\no\tKlonierung von Amidase kodierenden Sequenzen
\no\tKonstruktion einer DNA-GenBank Bibliothek
\no\tScreening der GenBank auf Substrat-Platten
\no\tInverse pCR
\no\tPolyacrylamid Gel Elektrophorese
\no\tEnzymatischer Nachweis der aktiven Proteine in Gelen
\no\tExpression rekombinanter Proteine<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die nativen Amidasen aus Thermocrispum municipale 4K und Pseudonocardia thermophila wurden planm\u00e4\u00dfig gereinigt und vollst\u00e4ndig charakterisiert. Beide Enzyme sind sehr thermoaktiv und zeigen maximale Aktivit\u00e4t bei 70\u00b0C. Die Amidase aus T. municipale 4K weist dar\u00fcber hinaus ein ungew\u00f6hnlich breites pH-Profil auf. Beide themoaktiven Amidasen verf\u00fcgen \u00fcber ein breites Substratspektrum und sind sehr resistent gegen\u00fcber Detergenzien und Reduktionsmitteln. Aufgrund dieser Eigenschaften verf\u00fcgen beide Enzyme \u00fcber ein gro\u00dfes Potenzial f\u00fcr eine industrielle Anwendung zur Herstellung von Carbons\u00e4uren und ungew\u00f6hnlichen Aminos\u00e4uren.
\nIm Laufe des Projekts konnten wie geplant zahlreiche Amidasegene aus extremophilen Mikroorganismen kloniert werden. Ziel war es, eine m\u00f6glichst gro\u00dfe Anzahl von Amidasen mit unterschiedlichen Eigenschaften f\u00fcr eine industrielle Nutzung zu erschlie\u00dfen. Die Klonierung von Amidasegenen aus A. gottschalkii, M. jannaschii, M. thermoautotrophicus, Aquifex aeolicus und T. maritima konnte erfolgreich durchgef\u00fchrt werden. Da die rekombinaten Amidasen in Form von unl\u00f6slichen inclusion bodies vorlagen, mussten unerwartet gro\u00dfe Anstrengungen unternommen werden, um L\u00f6sungsans\u00e4tze f\u00fcr diese Fragestellungen zu entwickeln. Anders als urspr\u00fcnglich geplant sind daher neben den Standard-Expressionssystemen (E. coli BL21) noch weitere Systeme getestet worden mit dem Ziel, die Bildung von inclusion bodies zu vermeiden bzw. signifikant zu reduzieren. Durch Fusion der Amidase mit verschiedenen colour tag Proteinen (CTP), die in E. coli sehr gut l\u00f6slich sind, wurde die L\u00f6slichkeit der rekombinaten Amidase verbessert. In weiteren Untersuchungen sollen die l\u00f6slichen rekombinanten Proteine nun charakterisiert und mit verschiedenen Substraten getestet werden.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Egorova, K., H. Trauthwein, S. Verseck, G. Antranikian. 2004. Purification and properties of an enantioselective and thermoactive amidase from the thermophilic actinomycete Pseudonocardia thermophila. Appl. Microbiol.&Biotechnol. 65, 1:38-45. <\/p>\n
Egorova, K., H. Trauthwein, G. Antranikian. 2004. A rapid and sensitive method for the detection of amidases in polyacrylamide gels and agar plates. J. Microb. Methods submitted.<\/p>\n
Egorova K., P. M\u00fcller, C. Vorgias, H. Trauthwein, S. Verseck, G. Antranikian. Thermophiles as sources of thermostable nitrile-degrading enzymes. International Congress on Biocatalysis, 29.08.-01.09.2004, Hamburg, Germany. P. 250.<\/p>\n
Egorova, K., H. Trauthwein, S. Verseck, G. Antranikian. The amidase from Pseudonocardia thermophila. German Patent. 21.03.2003. Submission number DE 103 12 842.<\/p>\n
Egorova, K., H. Trauthwein, G. Antranikian. A method for the detection of amidases in polyacrylamide gels and agar plates. German Patent. 2002. Submission number 10233686.5.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die Zusammenarbeit innerhalb des Projektkonsortiums verlief ausgezeichnet und sehr vertrauensvoll. Die Expertisen der Projektpartner erg\u00e4nzen sich sehr gut. Schwerpunkte lagen bei der AG Antranikian in der Bereitstellung extremophiler Mikroorganismen und in der Klonierung von Amidasegenen. Die molekularbiologische Seite wurde durch den Projektpartner X-Zyme GmbH hervorragend erg\u00e4nzt. Mit dem Industriepartner Degussa AG wurden m\u00f6gliche Strategien zur Umklonierung der Amidasen in ein industrielles Expressionssystem erarbeitet.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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