Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Im Projekt sollen f\u00fcr drei technisch interessante Oxidasen Expressionssysteme und parallel eine Analy-setechnologie f\u00fcr die Optimierung industrieller, oxidativer enzymatischer Prozesse entwickelt werden. Mit diesen Enzymen (L-Aminos\u00e4ureoxidase (L-AAO), D-Aminos\u00e4ureoxidase (D-AAO) und NADH-Oxidase (NOX)) sollen neue Syntheserouten f\u00fcr die Herstellung eines breiten Spektrums an D- und L-Aminos\u00e4uren, Ketos\u00e4uren, Alkoholen und Ketoverbindungen er\u00f6ffnet werden. Durch den Einsatz von En-zymen k\u00f6nnen gerade bei der Synthese chiraler Verbindungen schwermetallhaltige Katalysatoren und aufw\u00e4ndige Aufarbeitungsverfahren vermieden werden. H\u00e4ufig er\u00f6ffnen sich durch die Anwendung von Enzymen erst wirtschaftliche Synthesewege f\u00fcr die Herstellung chiraler Substanzen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenFeinchemikalien und chirale Vorl\u00e4ufermolek\u00fcle, die in der pharmazeutischen und chemischen Industrie eingesetzt werden, m\u00fcssen meist von sehr hoher Enantiomerenreinheit sein. In den letzten Jahren wurden unterschiedliche biokatalytische Systeme zur Produktion chiraler Feinchemikalien auch im industriellen Ma\u00dfstab etabliert, so dass Substanzen wie Alkohole, Amide und Aminos\u00e4uren auch im Tonnenma\u00dfstab enantiomerenrein hergestellt werden k\u00f6nnen. Der Einsatz von Oxidasen f\u00fcr die Herstellung enanti-omerenreiner Feinchemikalien wurde bisher wenig untersucht, obwohl diese Enzyme hoch stereoselektiv sind. Au\u00dferdem ist der Cofaktor (FAD\/FMN) fest gebunden, sodass eine externe Zugabe nicht erforder-lich ist. Ebenso ist f\u00fcr Enzyme dieser Gruppe kein zus\u00e4tzliches Coenzym-Regenerierungssystem erfor-derlich, da reduziertes FADH2 oder FMNH2 durch Sauerstoff reoxidiert wird. Potenziell interessante En-zyme wie L-Aminos\u00e4ureoxidasen und NADH-Oxidasen k\u00f6nnen noch nicht in ausreichender Menge her-gestellt werden, um sie f\u00fcr pr\u00e4parative Zwecke einzusetzen. \u00dcber genetische Methoden (HHU) und durch Optimierung der Fermentationsbedingungen (ACB) k\u00f6nnte die Verf\u00fcgbarkeit dieser Oxidasen jedoch auch verbessert werden. Bis heute sind zur Verfolgung enzymatischer Umsetzungen meist aufw\u00e4ndige Probennahmen mit anschlie\u00dfender Analytik (z. B. HPLC) notwendig, um das exakte Ende der Reaktion zu bestimmen. Als eine geeignete L\u00f6sung f\u00fcr eine Online-Verfolgung Oxidase-katalysierter Enzymreaktionen k\u00f6nnte sich das Respiration Activity Monitoring System (RAMOS) etablieren (HHU und ACB). Hauptziele des Projekts sind die Entwicklung effizienter Expressionssysteme f\u00fcr verschiedene technisch interessante Oxidasen und die Erforschung und Etablierung der RAMOS-Technologie auf dem Einsatz-gebiet der Enzymtechnologie. Das Projekt soll innerhalb von 2 Jahren durchgef\u00fchrt werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Oxidasen:
\nF\u00fcr alle Enzyme (NOX aus L. brevis, die D-AAO aus T. variabilis, die D-AAO aus A. protophormiae und die L-AAO aus R. opacus) konnten im Rahmen der Projektbearbeitung leistungsf\u00e4hige Expressionssys-teme entwickelt werden. Die gr\u00f6\u00dften Probleme gab es bei der Entwicklung eines geeigneten Expressi-onssystems f\u00fcr die L-spezifische AAO aus R. opacus, das h\u00e4ngt wahrscheinlich damit zusammen, dass dieses Enzym mit einer TAT-Signalsequenz exprimiert wird. Nach Optimierung auf genetischer Ebene konnten aber zwei gute Expressionssysteme (in Streptomyces lividans und in E. coli) erreicht werden. Die biochemischen Daten der jeweiligen Enzyme, m\u00f6glichst einschlie\u00dflich Inhibitorstudien und Strukturdaten stellen die wesentlichen Grundlagen f\u00fcr die Ausarbeitung biokatalytischer Verfahren dar. Die biochemi-schen Daten wurden f\u00fcr alle Enzyme umfassend aufgenommen, zwei Enzyme konnten kristallisiert wer-den. Oxidase-katalysierte Anwendungen konnten f\u00fcr alle Enzyme in kleinem Ma\u00dfstab umfassend bear-beitet werden. NOX wird f\u00fcr die NADRegenerierung bei der oxidativen Racemattrennung eingesetzt, die-se Verwendung wurde in gekoppelten Ans\u00e4tzen f\u00fcr die Synthese verschiedener R- und S-Alkohole und f\u00fcr diverse D-Aminos\u00e4uren aufgezeigt. In aller Regel werden ee-Werte von 95 bis praktisch 100 % er-reicht. D- und L-Aminos\u00e4ure-Oxidasen k\u00f6nnen insbesondere f\u00fcr die Darstellung von L- oder D-Aminos\u00e4uren eingesetzt werden; es werden immer enantiomerenreine Produkte erhalten. Im Projekt soll-ten f\u00fcr vier technisch interessante Oxidasen Expressionssysteme entwickelt werden.
\nFermentationsoptimierung:
\nBei der Tv-DAAO wurde eine Produktionsfermentation (E. coli) durchgef\u00fchrt, um Material (DAAO) f\u00fcr die
\nRAMOS-Versuche herzustellen. Diese Fermentation wurde nicht optimiert und spiegelt die Sch\u00fcttelkol-benergebnisse wider (12U\/mL). Bei der Fermentationsoptimierung der Ap-DAAO (E. coli) hat sich her-ausgestellt, dass ein exponentielles Feed-Profil die h\u00f6chste Aktivit\u00e4t (250U\/mL) aufweist. Weiterhin wur-de die Induktorkonzentration optimiert. Bei der Fermentation von Streptomyces lividans wurde im ersten Schritt die Vorkultur optimiert, mit dem Erfolg, dass die gleiche Morphologie im Sch\u00fcttelkolben wie im Fermenter erreicht wurde. Sowohl in Kolben mit als auch ohne Schikanen. Dies erm\u00f6glicht es Medienop-timierung im Sch\u00fcttelkolben durchzuf\u00fchren. Fermentationen im 40L Ma\u00dfstab spiegeln bei der spez. Akti-vit\u00e4t die Ergebnisse des Sch\u00fcttelkolbens wider. Induktionszeitpunktversuche im Sch\u00fcttelkolben haben gezeigt, dass eine dreifache Steigerung der spezifischen Aktivit\u00e4t (180mU\/mg) m\u00f6glich ist. Einen durch-schlagender Erfolg stellt aber die Etablierung des Expressionssystems E. coli dar, das vor dem Projekt-beginn als nicht realisierbar galt. Damit konnten die Ausbeuten um einen Faktor 170 gegen\u00fcber dem Wildtyp gesteigert werden. Die Hochzelldichtefermentationen der NOX (E. coli System) wurden wie er-wartet erfolgreich durchgef\u00fchrt.
\nRAMOS:
\nEin Ziel des Projekts war die RAMOS-Technologie in der Enzymtechnologie zu etablieren. Dieses Ziel wurde erreicht. Die Ergebnisse zeigen, dass die RAMOS-Technologie wertvolle Online-Daten liefert, mit deren Hilfe die Enzymstabilit\u00e4t, -aktivit\u00e4t und -inhibierung gemessen werden k\u00f6nnen, ohne gro\u00dfe Pro-benahme und Offline-Analytik-Aufwand. In diesem Projekt wurde nicht nur die Stabilit\u00e4t von Enzymen (D-AAO) bestimmt, sondern auch der Einfluss von anderen Stoffen (wie Wasserstoffperoxid) auf die En-zymaktivit\u00e4t. Weiterhin konnte mit parallelen Ans\u00e4tzen der Unterschied zwischen l\u00f6slichen und immobili-sierten Enzym herausgearbeitet werden. Bei der L-AAO konnte mit Hilfe der Online-Technologie eine Sub-stratinhibierung festgestellt werden. Sogar das gekoppelte System des NOX-Systems (Sauerstoff-verbrauch\/-produktion in der Enzymregenerierungsreaktion) konnte mit der RAMOS-Technologie ver-messen werden. Dieses Ergebnis erweitert nat\u00fcrlich den Anwendungsbereich dieser Technologie. Die Anwendung der RAMOS-Technologie war in diesem Projekt auf sauerstoffverbrauchende Enzymenreak-tionen beschr\u00e4nkt gewesen. Diese Beschr\u00e4nkung ist aber nicht zwingend notwendig, da fast jede gas-entwickelnde\/-verbrauchende Enzymreaktion (z. B. Kohlendioxid) mit dem RAMOS-System vermessen werden k\u00f6nnen. Der Einsatz dieser Technologie verringert stark die Probenanzahl, die mit Hilfe einer HPLC vermessen werden m\u00fcssen. Dadurch wird der Gebrauch von Einwegmaterialien und L\u00f6semitteln reduziert. Das Scale-Up der RAMOS-Technologie in den 7,5L Ma\u00dfstab ist mit herk\u00f6mmlichen Abgasana-lytiksystemen problemlos realisierbar.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die Ergebnisse des Projekts wurden auf folgenden Veranstaltungen ver\u00f6ffentlicht:
\n1) GVC Jahrestagung, M\u00fcnchen, 2004 2) BioPerspectives, Wiesbaden, 2004, 3) CphI, Br\u00fcssel, 2004
\n4) Biocat, Hamburg, 2004, 5) Bioforum, L\u00fcttich, 2004 6) BioPerspectives, Wiesbaden, 2005<\/p>\n
Publikationen:
\n–\tW. Hummel, M. Kuzu, B. Geueke (2003): An efficient and selective enzymatic oxidation system for the synthesis of enantiomerically pure D-tert-leucine. Organic Letters 5 (20):3649-50.
\n–\tW. Hummel, M. Kuzu, B. Geueke (2004): Oxidative resolution of racemic mixtures by the coupled use of dehydrogenases and NADH oxidase. Appl. Microbiol. Biotechnol. (in press).
\n–\tM. Kuzu, W. Hummel (2004): Preparation of D-amino acids by enantioselective oxidation catalyzed by recombinant Escherichia coli cells expressing L-leucine dehydrogenase and NADH oxidase. ChemBi-oChem (submitted).
\n–\tM. Kuzu, K. Niefind, W. Hummel, D. Schomburg (2005): Crystallization and preliminary crystallo-graphic analysis of a flavoprotein NADH oxidase from Lactobacillus brevis. Acta Crystallographica Sec-tion F 61: 528-30.
\n–\tM. Kuzu, W. Hummel (2005): Influence of the expression conditions on the formation of apo- and holoenzyme from Lactobacillus brevis NADH oxidase. Biochimica et Biophysica Acta (submitted).
\n–\tZ. Findrik, D. Vasi_-Ra_ki, M. Kuzu, W. Hummel (2005): Application of a new D-amino acid oxi-dase from Arthrobacter protophormiae. Engineering in Life Sciences (submitted).
\n–\tM. Kuzu, K. Niefind, W. Hummel, D. Schomburg (2005): S<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Projekt sollten f\u00fcr vier technisch interessante Oxidasen Expressionssysteme entwickelt werden. Die NOX aus L. brevis, die D-AAO aus T. variabilis, die D-AAO aus A. protophormiae und die L-AAO aus R. opacus wurden erfolgreich kloniert und heterolog exprimiert. In allen Expressionsst\u00e4mmen konnte eine hohe Proteinexpression erzielt werden. Weiterhin konnte die RAMOS-Technologie erfolgreich in der En-zymtechnologie (Oxidasen) als Alternative zur HPLC-Analytik etabliert werden. Der Einsatz der RAMOS-Technologie reduziert den Einsatz von L\u00f6sungsmitteln und Einwegmaterialen, die bei der HPLC-Technologie ben\u00f6tigt werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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