Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Die Anwendung von Biokatalysatoren in biotechnologischen Produktionsverfahren f\u00fchrt vielfach zu einer besseren Ausnutzung von Rohstoffen, einer Minimierung von Schadstoffemissionen und einer Herabsetzung des Energieverbrauchs bei gleichzeitig verbesserter Produktqualit\u00e4t und -reinheit. Aufgrund dieser Vorteile wird der Einsatz von Enzymen in industriellen Prozessen, in denen zz. noch chemische oder physikalische Verfahren dominieren, weiter zunehmen. Es ist daher von besonderer Relevanz, effiziente Expressionssysteme in mesophilen Wirtsorganismen zu optimieren und einzusetzen, um so die nat\u00fcrlichen Quellen von Biokatalysatoren – insbesondere extremophile Mikroorganismen – f\u00fcr Umwelt und Gesellschaft zu nutzen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIm Zuge des Projekts wurden aus extremophilen Mikroorganismen mit Hilfe molekularbiologischer Methoden Lipasegene erfolgreich kloniert und rekombinant in mesophilen Produktionsst\u00e4mmen exprimiert.
\nZur Produktion und Sekretion hitzestabiler rekombinanter Biokatalysatoren wurden die grampositiven Bakterien Staphylococcus carnosus und Bacillus subtilis sowie das alternative System der Hefe Pichia pastoris verwendet. Die im Rahmen des Vorhabens gewonnenen Erkenntnisse mit Lipasen k\u00f6nnen modellhaft auf andere biotechnologisch relevante Biokatalysatoren \u00fcbertragen werden.
\nDes Weiteren sollte die Ausbeute an rekombinanten Lipasen durch optimierte Fermentationstechniken im 1 l- und 20 l-Ma\u00dfstab erh\u00f6ht werden. Hierzu wurden Parameter wie beispielsweise Temperatur, R\u00fchrerdrehzahl, Begasung und Induktionszeitpunkt untersucht. Zus\u00e4tzlich sollte die technische Anwendbarkeit ausgew\u00e4hlter rekombinanter Enzyme getestet werden.
\nDie Hochdurchsatz-Bioproduktion von Lipasen setzt deren kontinuierliche Entfernung aus dem Bioreaktor voraus. Gleichzeitig muss der das Enzym sekretierende Mikroorganismus im Reaktor zur\u00fcckgehalten werden, um m\u00f6glichst hohe Zelldichten zu erzielen. Dies sollte im Rahmen des Projekts durch neuartige keramische Membranen und Membranmodule im Fermenter realisiert werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
In der Arbeitsgruppe von Prof. Freudl am Institut f\u00fcr Biotechnologie 1 des Forschungszentrums J\u00fclich wurden zwei Modell-Lipasen, die extrazellul\u00e4re Lipase GTL aus Geobacillus thermoleovorans IHI-91 sowie die im Cytosol lokalisierte Lipase TSL aus Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus mit Sec- bzw. Tat-Weg spezifischen Exportsignalen versehen. Durch die Klonierung solcher Genkonstrukte konnte eine sekretorische Proteingewinnung erreicht werden. Die rekombinanten Lipasen konnten \u00fcber den generellen Sekretionsweg (Sec-Weg) oder \u00fcber den alternativen Tat-Weg (twin-arginine-translocation) aus den Gram-positiven Produktionswirten Staphylococcus carnosus und Corynebacterium glutamicum in den Kultur\u00fcberstand sekretiert werden. In der von Dr. Thomas Sch\u00e4fer geleiteten Abteilung Bacterial Discovery Unit (Novozymes) wurde die Lipase aus T. thermohydrosulfuricus ohne Signalsequenz in Bacillus subtilis kloniert und extracellul\u00e4r expremiert.
\nDie Arbeitsgruppe Technische Mikrobiologie von Prof. Antranikian an der TU Hamburg-Harburg hat sich der Arbeit mit Lipasen aus thermophilen und psychrophilen Organismen gewidmet. Die Klonierungen der Lipasen aus den anaeroben thermophilen Organismen, Caldanaerobacter subterraneus subspec. tengcongensis, Thermoanaerobacter thermohydrosulfuricus in E. coli in den Expressionsvektor pETBlue-1 wurden erfolgreich abgeschlossen. Die Lipasen wurden unter der Kontrolle des T7lac-Promotors intrazellul\u00e4r exprimiert. Die rekombinanten Enzyme wurden durch eine hydrophobe Interaktions- und eine Gelfiltrationschromatographie aufgereinigt und anschlie\u00dfend charakterisiert. Die aufgereinigten rekombinanten Enzyme sind aktiv im Temperaturbereich von 40 bis 90 \u00b0C. Die Lipasen aus C. subterraneus subspec. tengcongensis und aus T. thermohydrosulfuricus sind aktiv in dem pH-Bereich von 6,5 bis 10,0. Eine k\u00e4lteaktive Lipase aus der psychrophilen Hefe Mrakia gelida konnte aus dem Kultur\u00fcberstand des Wildtyps mit einem Reinigungsschritt isoliert werden. Diese psychrophile Lipase wurde anschlie\u00dfend charakterisiert. Mit Hilfe von degenerierten Primern und inverser PCR sowie einigen Primer-walking Schritten konnte eine Lipasegen-Sequenz ermittelt werden. Das hypothetische Lipasegen ist bereits in E. coli kloniert. Die Klonierung der Lipase aus dem thermoalkaliphilen Organismus Anaerobranca gottschalkii in das Expressionssystem der Hefe Pichia pastoris war ebenfalls erfolgreich. Die rekombinante Lipase wurde mittels hydrophober Interaktions- und Gelfiltrationschromatographie gereinigt und anschlie\u00dfend charakterisiert. Pichia pastoris l\u00e4sst sich als bereits etabliertes Expressionssystem problemlos im Fermenter kultivieren. Gemeinsam mit dem Kooperationspartner Prof. Chmiel, Gesellschaft f\u00fcr umweltkompatible Prozesstechnik mbH an der Universit\u00e4t des Saarlandes, wurde eine keramische Mehrkanal-Flachmembran in einen Versuchsfermenter integriert. Mit Hilfe der in den Fermenter integrierten Dialysemembran wurde eine extrazellul\u00e4re Lipase aus T. brockii subsp. brockii aus dem laufenden Produktionsprozess entnommen.
\nDie neuartige keramische Mehrkanal-Flachmembran (Patent-Nr. DE 197 49 411.0) wurde innerhalb des Projekts hinsichtlich der Trenneigenschaften (Porendurchmesser) und der Wechselwirkung mit dem Kulturmedium (Fouling) optimiert. Zus\u00e4tzlich wurden an die Fermentationsbedingungen angepasste sterilisierbare Module entwickelt (Patent-Nr. DE 197 49 411.0). Der Einsatz der Membran und der Membranmodule zur Abtrennung der Biokatalysatoren bereits w\u00e4hrend der Fermentation gelang bei unterschiedlichen Enzym-Produzenten.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Pr\u00e4sentation des Projekts auf dem International Congress on Extremophiles 2004, Baltimore, USA.
\nPosterpr\u00e4sentation auf der BioPerspectives 2004 in Wiesbaden, Deutschland.
\nZwei Artikel \u00fcber die Charakterisierung der thermo-aktiven Lipasen aus T. thermohydrosulfuricus und C. subterraneus subspec. tengcongensis sind bereits angefertigt.
\nVortrag und Posterpr\u00e4sentationen auf der VAAM Jahrestagung 2005 in G\u00f6ttingen, Deutschland.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Sowohl die Klonierungen, die rekombinante Expression der Lipasen in E. coli und P. pastoris sowie in Staphylococcus carnosus und Corynebacterium glutamicum als auch die Charakterisierung der Lipasen wurden abgeschlossen (AG Prof. Antranikian und AG Prof. Freudl). Somit wurden vier hitzestabile Lipasen erfolgreich rekombinant produziert und eine k\u00e4lteaktive Lipase charakterisiert. Die Konstruktion und Optimierung der Mehrkanal-Flachmembran war erfolgreich. Die enge Kooperation und der Erfahrungsaustausch mit den Projektpartnern ItN Nanovation GmbH und der Gesellschaft f\u00fcr umweltkompatible Prozesstechnik mbH (Prof. Chmiel) erm\u00f6glichten einen reibungslosen Einbau des Membran-Moduls, so dass modellhafte Fermentationversuche mit verschiedenen Organismen durchgef\u00fchrt werden konnten. Der Einsatz des Expressionssystems von P. pastoris erweist sich zur Produktion der Lipase aus Anaerobranca gottschalkii als nachteilig, da die Lipase zellmembrangebunden vorlag. In nachfolgenden Versuchen konnte eine Lipase bereits w\u00e4hrend einer kontinuierlich laufenden Fermentation mittels der neuartigen Mehrkanal-Flachmembran gewonnen werden. Die Fermentationsversuche mit der neuartigen Membran zeigten, dass Biokatalysatoren zuk\u00fcnftig schnell und \u00e4u\u00dferst wirtschaftlich produziert werden k\u00f6nnten.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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