Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Glyoxyls\u00e4ure, OHC-COOH, ist ein hochinteressanter Ausgangsstoff f\u00fcr die Synthese verschiedener heterocyclischer Verbindungen, Antibiotika, Polyacrylamide, Benzaldehyde und pharmazeutischer Bausteine. Die Herstellung von Glyoxyls\u00e4ure erfolgt bisher chemisch durch Oxidation von Glyoxal mit Salpeters\u00e4ure. Dieses Verfahren ist energieintensiv und f\u00fchrt aufgrund der Bildung von Oxals\u00e4ure zu einer schlechten Ausbeute. Obwohl Glyoxylat ein zentrales Stoffwechselintermediat in vielen Organismen darstellt, wurden unseres Wissens nach bisher keine Forschungsarbeiten zur biotechnologischen Produktion von Glyoxylat aus Zuckern publiziert. Das Ziel des geplanten Projekts ist die Entwicklung eines neuen, nachhaltigen und umweltschonenden Verfahrens zur Herstellung von Glyoxylat aus Zucker mit Hilfe von rekombinanten Bakterien-St\u00e4mmen (Escherichia coli, Corynebacterium glutamicum) inklusive der dazugeh\u00f6rigen Produktaufarbeitungstechnik und zwar bis in den Technikumsma\u00dfstab.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDas vorgestellte Gemeinschaftsprojekt von IBT-1, IBT-2 und der bitop AG zielt darauf ab, alternativ zur bisherigen chemischen Produktion des \u0082bulk-Produkts Glyoxylat aus (chemisch hergestelltem) Glyoxal ein biotechnologisches Verfahren zur Glyoxylat-Produktion aus dem nachwachsenden Rohstoff Glucose zu etablieren, das einen signifikanten Beitrag zur Umweltentlastung leistet und \u00f6konomisch konkurrenzf\u00e4hig ist. Das Projekt besteht aus drei Teilprojekten:
\n\u00b7\tKonstruktion und Charakterisierung von bakteriellen Glyoxylat-Produktionsst\u00e4mmen basierend auf E. coli oder C. glutamicum (IBT-1, Prof. M. Bott)
\n\u00b7\tEntwicklung eines mikrobiellen Produktionsprozesses inklusive der dazugeh\u00f6rigen Produktaufarbeitung und Stoffwechselquantifizierung (IBT-2, Dr. R. Takors)
\n\u00b7\t\u00dcbertragung der Labor- und Pilotergebnisse in den technischen Ma\u00dfstab und beginnende Vermark-tung des Produkts Glyoxylat (bitop AG, Dr. T. Schwarz)<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Ziel des vorliegenden Projekts war die Entwicklung eines biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung des bulk-Produkts Glyoxylat aus Glucose mit Hilfe von rekombinanten Bakterienst\u00e4mmen, die Glyoxylat mittels der Isocitratlyase bilden, aber nicht weiter umsetzen k\u00f6nnen. Aufgrund einer hohen Resistenz ge-gen\u00fcber extern zugegebenem Glyoxylat wurde Escherichia coli als geeigneter Stamm ausgew\u00e4hlt. Nach vergeblichen Versuchen mit dem Stamm MG1655 konnten in dem nahe verwandten Stamm W3110 sukzessive die Gene f\u00fcr Malat-Synthase G (glcB), Isocitrat-Dehydrogenase (icd), Malat-Synthase A (aceB) und Glyoxylat-Carboligase (gcl) deletiert werden. Die resultierenden Mutanten wurden D1, D2, D3 und D4 genannt. Die drei letztgenannten St\u00e4mme sind aufgrund der icd-Deletion glutamat-auxotroph. Der W3110D4-Stamm kann nicht mehr auf Glyoxylat als einziger Kohlenstoffquelle wachsen. Um die Isocitratlyase \u00fcberzuproduzieren, wurden die aceA-Gene von Corynebacterium glutamicum und E. coli in verschiedene Vektoren kloniert und die resultierenden Plasmide in den Stamm W3110D4 transferiert.
\nDie Kultivierung der St\u00e4mme W3110D3 und W3110D4 mit bzw. ohne aceA-Expressionsplasmide in Sch\u00fcttelkolben sowie im Fermenter f\u00fchrte in allen F\u00e4llen zu \u00e4hnlichen Resultaten: die St\u00e4mme bildeten in erster Linie Acetat, Pyruvat und Lactat, aber kein Glyoxylat. Auch die Supplementation mit Citrat, Succinat, Malat oder Aspartat f\u00fchrte nicht zu einer Glyoxylat-Bildung. Neben Versuchen mit wachsenden Zel-len wurde eine Vielzahl von Experimenten mit ruhenden Zellen durchgef\u00fchrt, wobei als Substrate neben Glucose auch Acetat, Citrat, Succinat und Malat getestet wurden. Auch bei diesen Biotransformationen wurden in erster Linie Acetat, Pyruvat und Lactat gebildet, aber kein Glyoxylat. Um auszuschlie\u00dfen, dass ein fehlender Export die Ursache f\u00fcr das Ausbleiben der Glyoxylat-Bildung darstellt, wurden Versuche mit Triton X-100 behandelten Zellen durchgef\u00fchrt. Diese zeigten eine 90 %ige Reduktion der Glucose-Verbrauchsrate, aber keine Glyoxylat-Bildung.
\nZur Aufarbeitung von Glyoxylat aus dem Fermentationsmedium wurden zwei Verfahren getestet, die Re-aktiv-Extraktion mit Zentrifugalextraktoren sowie die Elektrodialyse. Bei der Reaktivextraktion wurde eine 30 %ige L\u00f6sung von Trioctylmethylammoniumchlorid in Octanol als geeignete L\u00f6sungsmittelphase identifiziert sowie eine 10 %ige NaCl-L\u00f6sung als geeignete Akzeptorphase. Unter den getesteten Bedingungen konnte innerhalb von 6 h eine Donorphase mit 10 g\/l Glyoxylat auf unter 2 g\/l abgereichert werden mit einem Gesamtextraktionsgrad von 64 %. Bei der Elektrodialyse wurde eine Modelll\u00f6sung (E. coli-Fermentationsl\u00f6sung mit zugesetztem Na-Glyoxylat) zun\u00e4chst \u00fcber einen selektiven Ionenaustauscher von mehrwertigen Kationen befreit und anschlie\u00dfend in die Elektrodialyse eingesetzt. Mit homopolaren Membranen konnte Na-Glyoxylat mit einem Faktor von 2.8 angereichert werden. Bei der anionischen bi-polaren Elektrodialyse konnte Na-Glyoxylat mit einer Konversionsrate von >95 % in Glyoxyls\u00e4ure \u00fcberf\u00fchrt und um mehr als den Faktor 4 angereichert werden.
\nZusammenfassend l\u00e4sst sich feststellen, dass die geplanten Stammkonstruktionen zwar erfolgreich durchgef\u00fchrt werden konnten, die erhaltenen St\u00e4mme aber nicht die gew\u00fcnschte Umsetzung von Glucose zu Glyoxylat katalysieren. Es scheint eine Blockade beim Eintritt in den Citrat-Zyklus zu geben, die da-zu f\u00fchrt, dass das im Zuge der Glykolyse gebildete Acetyl-CoA gr\u00f6\u00dftenteils in Acetat umgesetzt wird. M\u00f6glicherweise tolerieren die Zellen nur sehr geringe intrazellul\u00e4re Konzentrationen von Glyoxylat und besitzen einen Schutzmechanismus, der beim Erreichen einer bestimmten Schwellenkonzentration die weitere Bildung von intrazellul\u00e4rem Glyoxylat durch die Isocitratlyase verhindert.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Das Projekt und die erzielten Ergebnisse wurde im Rahmen der IC-Bio-Verbundtreffen vorgestellt. Aufgrund der Tatsache, dass das Hauptprojektziel nicht erreicht wurde, wurde auf eine Pr\u00e4sentation der Daten im Rahmen von Tagungen verzichtet.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Obwohl die geplanten metabolic engineering-Arbeiten mit Escherichia coli erfolgreich durchgef\u00fchrt werden konnten, katalysierten die erhaltenen St\u00e4mme nicht die gew\u00fcnschte Umsetzung von Glucose zu Glyoxylat. Die Ursache daf\u00fcr konnte nicht identifiziert werden. Hinsichtlich der Aufarbeitung von Glyoxylat aus w\u00e4ssriger L\u00f6sung konnten zwei alternative Verfahren etabliert werden, die Reaktivextraktion und die Elektrodialyse. Da ein erfolgreicher Abschluss des Projekts innerhalb des von der DBU gesetzten Zeit-rahmens von zwei Jahren nicht absehbar war, wurde das Projekt nach 18 Monaten Laufzeit beendet.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens Glyoxyls\u00e4ure, OHC-COOH, ist ein hochinteressanter Ausgangsstoff f\u00fcr die Synthese verschiedener heterocyclischer Verbindungen, Antibiotika, Polyacrylamide, Benzaldehyde und pharmazeutischer Bausteine. Die Herstellung von Glyoxyls\u00e4ure erfolgt bisher chemisch durch Oxidation von Glyoxal mit Salpeters\u00e4ure. Dieses Verfahren ist energieintensiv und f\u00fchrt aufgrund der Bildung von Oxals\u00e4ure zu einer schlechten Ausbeute. Obwohl Glyoxylat ein zentrales […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[47,65,52,53],"class_list":["post-23295","projektdatenbank","type-projektdatenbank","status-publish","hentry","tag-klimaschutz","tag-nordrhein-westfalen","tag-umweltforschung","tag-umwelttechnik"],"meta_box":{"dbu_projektdatenbank_az_ges":"13088\/01","dbu_projektdatenbank_medien":"","dbu_projektdatenbank_pdfdatei":"A-13088.pdf","dbu_projektdatenbank_bsumme":"247.280,00","dbu_projektdatenbank_firma":"Forschungszentrum J\u00fclich GmbH\nInstitut f\u00fcr Biotechnologie 1","dbu_projektdatenbank_strasse":"Postfach","dbu_projektdatenbank_plz_str":"52425","dbu_projektdatenbank_ort_str":"J\u00fclich","dbu_projektdatenbank_p_von":"2003-07-01 00:00:00","dbu_projektdatenbank_p_bis":"2005-06-30 00:00:00","dbu_projektdatenbank_laufzeit":"1 Jahr und 12 Monate","dbu_projektdatenbank_telefon":"02461-61-3294","dbu_projektdatenbank_inet":"www.fz-juelich.de","dbu_projektdatenbank_bundesland":"Nordrhein-Westfalen","dbu_projektdatenbank_foerderber":"80","dbu_projektdatenbank_ab_bericht":"","dbu_projektdatenbank_ist_nachbewilligung_von":"","dbu_projektdatenbank_hat_nachbewilligung":"","dbu_headerimage_cover":"","dbu_submenu":"","dbu_submenu_position":"","dbu_submenu_entry":[]},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/23295","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/projektdatenbank"}],"version-history":[{"count":2,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/23295\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":42858,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/23295\/revisions\/42858"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=23295"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=23295"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=23295"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}