Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Pathogene Mikroorganismen sind aufgrund stetig steigender Resistenzen ein schwerwiegendes Problem f\u00fcr Mensch und Umwelt und erfordern die Entwicklung hochspezifischer Wirkstoffe. Die entwickelten TOP-Screening Verfahren k\u00f6nnen, (1) die Anzahl der zu testenden Substanzen deutlich reduzieren, (2) ihre Zell- und Target-Spezifit\u00e4t schon im Screening erfassen und (3) RNA-Aptamere als neue Substanzklasse f\u00fcr das in vivo Screening erschlie\u00dfen. Dadurch werden Entwicklungskosten nachhaltig gesenkt und die Vertr\u00e4glichkeit f\u00fcr Mensch und Umwelt schon in das fr\u00fche Screeningverfahren einbezogen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie im Projektverlauf eingesetzten und weiterentwickelten TOP-Testsysteme auf Basis des Modellorganismus Saccharomyces cerevisiae greifen Vorteile der bisherigen in vitro und in vivo Testverfahren auf und kombinieren sie so, dass Zellspezifische, Target-spezifische und gleichzeitig intrazellul\u00e4r wirksame Stoffe entwickelt werden k\u00f6nnen.
\nDas TOP-SE-Verfahren ist ein bioinformatisches Verfahren zur gezielten Vorselektion einer Substanz-Bibliothek. Es trainiert mit bekannten Inhibitoren der Zielorganismen ein neuronales Netzwerk.
\nDas TOP-HS-Verfahren identifiziert den Wirkort von Substanzen bereits w\u00e4hrend der Wirkstoffsuche und trifft Aussagen \u00fcber Potenzial und Einsatzm\u00f6glichkeiten im Hinblick auf Toxizit\u00e4t und Umweltrelevanz.
\nDas TOP-DS-Verfahren nutzt Unterschiede zwischen funktionsgleichen Proteinen aus. Trotz hoher Selektivit\u00e4t ist dabei eine tiefgehende Kenntnis \u00fcber die physiologische Aufgabe der Zielstruktur nicht notwendig.
\nF\u00fcr das Screening von RNA-Aptameren als Target-spezifische Inhibitoren steht ein zweistufiges Verfahren zur Verf\u00fcgung. Zun\u00e4chst wird ein hochkomplexer RNA-Aptamerpool mit dem Selex-Verfahren an ausgew\u00e4hlten Protein-Targets in vitro angereichert, der anschlie\u00dfend in einem in vivo Selektionsverfahren (TOP-SCD) eingesetzt wird. Das TOP-SCD-Verfahren erm\u00f6glicht das Differenz-Screening von RNA-Aptamer-Bibliotheken in einer einzigen Testzelle und damit die in vivo Selektion von RNA-Aptameren, die Target-Proteine spezifisch inhibieren.
\nMit den genannten Verfahren werden Ressourcenschonende Technologien zur Verf\u00fcgung gestellt, die es erlauben, die Zahl der zu testenden Substanzen erheblich zu reduzieren und mit denen neue hochselektive Wirkstoffe entwickelt werden k\u00f6nnen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Alle wesentlichen Antragsziele des Projekts konnten erreicht werden. Abweichend vom Projektantrag wurden f\u00fcr das Substanzscreening keine Naturextrakte eingesetzt. Alternativ hierf\u00fcr wurden bioinformatische Verfahren erarbeitet, die das Erstellen fokussierter Substanzbibliotheken erm\u00f6glichten. Die Arbeiten zur in vitro Anreicherung von RNA-Aptameren waren zeitlich umfangreicher, da sich die RNA-Aptamerselektion gegen Proteine als wesentlich schwieriger erwies als eine RNA-Aptamerselektion ge-gen Peptide, f\u00fcr die Expertise zu Projektbeginn vorlag. Inzwischen konnte die in vitro Aptamerselektion f\u00fcr die Dihydrofolat Reduktase erfolgreich abgeschlossen werden. Experimentelle Schwierigkeiten sind bei der in vivo Selektionsphase aufgetreten. Zum einen ergaben sich deutlich unterschiedlicher Expressionsst\u00e4rken zwischen der C. albicans und der humanen Dihydrofolat-Reduktase, wodurch ein selektives Inhibieren der 200-fach aktiveren C. albicans Dihydrofolat-Reduktase durch die in vitro vorselektierten RNA-Aptamere nicht zu erwarten ist. Zum anderen ist die Expression der RNA-Aptamere im Cytoplama zurzeit zu gering, um auch bei niedriger Dihydrofolat-Reduktase Aktivit\u00e4t eine Inhibierung zu erwarten. Dieser Ansatz wird aber nach wie vor als Erfolg versprechend beurteilt, weshalb die Arbeiten von der SRD GmbH und der Goethe-Universit\u00e4t weitergef\u00fchrt werden. Ein nachhaltiger Durchbruch bei der Erstellung von Substanzbibliotheken ist mit den entwickelten bioinformatischen Verfahren und den sich daran anschlie\u00dfenden Ganzzell-Assays gelungen. Bereits bei einem Bibliotheksumfang von nur 2.000 Substanzen ist die Identifizierung von 3 h\u00f6chstspezifischen Wirkstoffgrundstrukturen gelungen, die stark zytotoxische Effekte auf die Hefen S. cerevisiae, C. albicans und C. glabrata aufweisen, jedoch keine zytotoxischen Effekte mit einer humanen Zelllinie (HaCaT – immortalisierte humane Keratinozyten Zelllinie) zeigen. Das TOP-HS (TOP Haplotoxizit\u00e4ts-Screening) ist eine Assay-Plattform zur Vorhersage von Wirkstoff-Target-Beziehungen. Es verkn\u00fcpft auf einzigartige Weise die Spezifit\u00e4t eines targetorientierten Ver-fahrens mit der Aussagekraft und der Robustheit eines Ganzzell-Assays. Die konkurrierende Mikroarray-Technologie war jedoch f\u00fcr viele Substanzen mit bekanntem Wirkmechanismus nicht in der Lage, das literaturbeschriebene Target korrekt zu identifizieren. Der direkte Vergleich mit ersten Validierungs-Daten, die im TOP-HS erzielt wurden, deutet daher darauf hin, dass das TOP-HS f\u00fcr viele Wirkstoffklassen besser geeignet ist. Mit Hilfe der TOP-HS Wirkprofile f\u00fcr Methotrexat als auch f\u00fcr Benzimidazole konnte der Wirkmechanismus dieser Substanzen nachvollzogen werden. Hier waren die Ergebnisse von besserer Qualit\u00e4t als die des Mitwettbewerbers Rosetta Inpharmatics, der anhand des Wirkprofils f\u00fcr Methotrexat keinen Wirkmechanismus zuordnen konnte. Mit dem TOP-HS-Verfahren ist es gelungen, den Wirkmechanismus bei beiden neuen Grundstrukturen zu beschreiben. 23E10 hemmt spezifisch ein Protein der Ergosterolbiosynthese, w\u00e4hrend 37H07 spezifisch ein Regulationsprotein der ribosomalen Biogenese angreift. Beide Grundstrukturen sind als neu zu bewerten und vielversprechende Substanzen f\u00fcr eine anschlie\u00dfende Wirkstoffentwicklung z. B. im Rahmen einer iterativen Wirkstoffoptimierung unter Verwen-dung der TOP-DS-Plattform. Das TOP-DS-Verfahren konnte f\u00fcr die in vivo Selektion von RNA-Aptameren weiterentwickelt (TOP-SCD) und ein Proof of Concept erarbeitet werden. Dieser Ansatz erm\u00f6glicht erstmals die Untersuchung der Wirkung von RNA-Molek\u00fclen in der Zelle auf Zielstrukturen. Mit Hilfe dieses Ansatzes ist es m\u00f6glich, RNA-Molek\u00fcle bzw. Aptamere zu identifizieren, die kleinste Unter-schiede \u00e4hnlicher Proteine spezifisch erkennen und nur die Zielstrukturen hemmen ohne \u00e4hnliche Strukturen des Wirts bzw. des Menschen zu beeinflussen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
\u00dcber das Projekt wurde in der folgenden Ver\u00f6ffentlichung berichtet: Entian, K.-D., Eschrich, D., Reckten-wald, J., Gassenmeier, T., S\u00e4ttler, A., Hauf, D., Klein, J. und Rimmele, M. (2003): Transkript Sonderband 2003, 42-43. Die Arbeiten wurden als Posterpr\u00e4sentation bei der Veranstaltung BioPerspectives am 04.06.04 in Wiesbaden vorgestellt. Aus den Arbeiten ist ein Wirkstoffpatent hervorgegangen, das am 18.02.2005 angemeldet wurde: Patentanmeldung H06535<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Projektverlauf konnten die TOP-Screeningsysteme erfolgreich aufgebaut und verifiziert werden. Es ist gelungen 3 antifungale Substanzen zu identifizieren, die spezifisch das Wachstum von C. albicanse nicht aber humaner Zellen inhibieren. F\u00fcr das neu entwickelte TOP-SCD existieren keine vergleichbaren Verfahren. Zwar sind einige kleine Biotechnologie-Unternehmen, die sich auf die Herstellung von Aptameren fokussieren, etabliert, jedoch beruhen die Methoden zu deren Selektion auf rein biochemischen in vitro Verfahren. Die Verkn\u00fcpfung von in vitro Vorselektion und in vivo Screening ist neu und wird in dieser Form von keinem Wettbewerber angeboten, allerdings sind hier \u00fcber den Projektzeitraum noch experimentelle Fragestellungen (Expressionsst\u00e4rken der Targetproteine und cytoplamatische Expression der RNA-Aptamere) zu l\u00f6sen. Das TOP-HS-Verfahren hat sich bei der Targetidentifizierung antifungaler Substanzen bew\u00e4hrt. Es existieren sehr wenige Technologien, die sich mit der Targetidentifizierung antifungaler Substanzen befassen. Rosetta Inpharmatics nutzt eine dem TOP-HS vergleichbare Technologie. Das TOP-HS-Verfahren erwies sich jedoch als aussagekr\u00e4ftiger. Durch den Einsatz einzelner St\u00e4mme mit jeweils seinem Wildtyp-Referenzstamm anstelle eines Stammgemischs ist das TOP-HS-Verfahren weniger fehleranf\u00e4llig, robuster und au\u00dferdem sensitiver. Zudem ist die Auswertung einfacher. Mit dem TOP-HS konnte z. B. das von Rosetta nicht gefundene Target von Methotrexat klar identifiziert werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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