Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
T\u00e4glich werden neue Wirkstoffe und Chemikalien f\u00fcr die F\u00f6rderung der Gesundheit bzw. Bek\u00e4mpfung von Krankheiten und die Befriedigung verschiedenster anderer menschlicher Bed\u00fcrfnisse entwickelt und neu in den Verkehr gebracht. Jeder dieser Stoffe bringt aber auch ein mehr oder weniger gro\u00dfes Gesundheits- und Umweltrisiko mit sich. Aus diesem Grund gibt es ein breites Spektrum von Methoden, mit denen erw\u00fcnschte und unerw\u00fcnschte Wirkungen von Wirkstoffen und Chemikalien und deren Metabolismus untersucht werden. In vielen Bereichen m\u00fcssen f\u00fcr derartige Untersuchungen immer noch umstrit-tene Tierversuche durchgef\u00fchrt werden. Sehr fr\u00fche und kosteng\u00fcnstige Studien vermindern Entwicklungsrisiken \u00f6konomischer, \u00f6kologischer und sozialer Art. Im vorliegenden Projekt werden Mikrotiterplattenreaktoren mit integrierten optischen Sensoren f\u00fcr Sauerstoff sowie auf Respirationsmessungen beruhende Methoden zur Untersuchung des Metabolismus und der Toxizit\u00e4t von Wirkstoffen entwickelt.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Firmen Microcoat und PreSens entwickelten 96er Mikrotiterplatten mit integrierter Sauerstoffmessung, die auch zur Kultivierung adh\u00e4renter S\u00e4ugerzellen geeignet sind. Hierzu wurden bei PreSens geeignete Sensormaterialien f\u00fcr zellkulturkompatible Sensoren entwickelt. Microcoat erarbeitete Beschichtungstechniken f\u00fcr den Sensor und f\u00fcr die Kompatibilit\u00e4t mit den S\u00e4ugerzellen. In der Technischen Biochemie der Universit\u00e4t des Saarlandes wurden Methoden zur Bestimmung der Respirationsraten entwickelt. Dies geschah unter Zuhilfenahme von mathematischer Modellierung und Simulation. Across Barriers und Pharmacelsus besch\u00e4ftigten sich vor allem mit der Untersuchung des Metabolismus von Wirk-stoffen. Dabei wurden von Across Barriers isolierte Mikrosomen mit entsprechenden Cytochromen P450 eingesetzt. Pharmacelsus konnte eine Methode zur online Bestimmung der Lebensf\u00e4higkeit von Hepatocyten entwickeln, die dann f\u00fcr die Untersuchung des Wirkstoffabbaus eingesetzt wurde. So konnten cyto-toxische Effekte neuer Wirkstoffe schnell und einfach bestimmt werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
F\u00fcr ein neues Verfahren zur Messung der Sauerstoffkonzentration w\u00e4hrend der Kultivierung von Zellen wurden chemisch-optische Sauerstoffsensoren f\u00fcr 96-well Mikrotiterplatten (MTP) mit Flachboden entwi-ckelt, die dann als Mikroreaktoren eingesetzt werden. Besonderes Augenmerk lag auf den Haftungseigenschaften der Sensorschichten in den verwendeten MTP, der M\u00f6glichkeit von Sekund\u00e4rbeschichtungen sowie der Unempfindlichkeit der Messmethodik auf St\u00f6reinfl\u00fcsse durch andere Medienkomponenten und Zellen.
\nDiese MTP konnten in diesem Projekt erfolgreich zur Kultivierung proliferierender adh\u00e4renter S\u00e4ugerzellen eingesetzt werden. Ohne zus\u00e4tzliche Sekund\u00e4rbeschichtung konnte der Sauerstoffverbrauch sowohl von humanen Coloncarcinomzellen (Caco2) als auch von humanen embryonalen Nierenzellen quantifiziert werden. Die Menge des verbrauchten Sauerstoffs war dabei proportional zur einges\u00e4ten Zellzahl. Eine zus\u00e4tzliche Beschichtung der Sensorplatten mit Collagen erm\u00f6glichte die Kultur prim\u00e4rer Hepatozyten aus der Ratte. Auch hier war die Sauerstoffkonzentration in der Platte abh\u00e4ngig von der eingesetzten Zellzahl, allerdings verschieden von Caco2, da prim\u00e4re Hepatozyten nicht zur Zellteilung in der Lage sind. Die neuen MTP konnten in Cytotoxizit\u00e4tsassays mit bekannten Referenzsubstanzen eingesetzt werden und lieferten LC50-Werte, die gut mit der Literatur \u00fcbereinstimmen. Diese Experimente zeigten, dass die Messung des Sauerstoffverbrauchs die konventionelle Lebensf\u00e4higkeitsbestimmung in der Zellkultur er-setzen kann.
\nAuch bei Suspensionszelllinien wie CHO, die weit verbreitet in der Produktion therapeutischer Proteine sind, ist die in den Mikrotiterplatten gemessene Sauerstoff-Aufnahmerate ein gutes Ma\u00df f\u00fcr die Lebensf\u00e4higkeit der Zellen zur Bestimmung der Toxizit\u00e4t von Substanzen und f\u00fcr die Optimierung von N\u00e4hrmedien.
\nMit den neuen MTP wurde der metabolische Arzneistoffabbau unter Einsatz von Mikrosomen mit Cytochrom P450 verfolgt, wobei der Sauerstoffverbrauch bei der Oxidation von Xenobiotika \u00fcber das P450 System (Monooxygenaseaktivit\u00e4t) vermessen wurde. Mit gepoolten Lebermikrosomen treten im Gegensatz zu isoliertem Cyp3A4 unspezifische Nebenreaktionen auf, die eine Versuchsauswertung erschweren. Als Modellarzneistoffe wurden Verapamil und Testosteron \u00fcberpr\u00fcft.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
–\tHeinzle, E., Deshpande, R. Bock, U., John, G., Krause, C., M\u00fcller, G., Waltenberger, H., Maas, R. (2003): Entwicklung von innovativen Mikrotiterplattenreaktoren zur Bewertung des Abbaus und der Toxizit\u00e4t neuer Wirkstoffe auf Basis von Mikrosomen und S\u00e4ugerzellen. transkript Sonderband Bio-katalyse, 66-67.
\n–\tDeshpande, R.R., Heinzle, E. (2004): Animal Cell Culture Using Microplates with Integrated Oxygen Sensors: Oxygen Uptake Rate and Cell Viability. Biotechnol. Lett., 26:763-767.
\n–\tDeshpande, R.R., Wittmann, C., Heinzle, E. (2004): Microplates with integrated oxygen sensing for medium optimization in animal cell culture. Cytotechnol. 46:1-8.
\n–\tDeshpande, R.R., Kirsch, Y., Maas, R., John, G.T., Krause, C., Heinzle, E. (2005): Microplates with Integrated Oxygen Sensors for Kinetic Cell Respiration Measurement and Cytotoxicity Testing in Primary and Secondary Cell Lines. ASSAY Drug Devel. Technol. 3: 299-307.
\n–\tDeshpande, R.R., John, G., Heinzle, E. (2003): Cultivation and Oxygen Uptake Rate of CHO Cells in Microtitre Plates with Integrated Dissolved Oxygen Sensing. Poster am 11th European Congress on Biotechnology, Basel, Switzerland – 24-29.08.2003
\nDas Projekt wurde auf dem DBU-Stand der Biotechnica 2003 mit einem Poster und mit einem Flyer pr\u00e4sentiert.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
In der hier vorliegenden Studie ist es erstmals gelungen, eine 96-well-O2-Sensorplatte mit Flachboden zu entwickeln, welche zur Kultur adh\u00e4renter Zellen geeignet ist. Sowohl Zelllinien als auch prim\u00e4re Zellen k\u00f6nnen auf der Platte kultiviert werden und zur Sauerstoffmessung herangezogen werden. Die Sauerstoffmessung liefert Daten \u00fcber die Lebensf\u00e4higkeit der kultivierten Zellen und kann zur Bestimmung der Toxizit\u00e4t neuer Wirkstoffe eingesetzt werden. Die erhaltenen Sauerstoffdaten w\u00e4hrend der Kultur der proliferierenden Zelllinien korrelieren gut mit Daten, die mit einem konventionellen MTT-Test erhalten wurden und k\u00f6nnen somit zur Bestimmung der Lebensf\u00e4higkeit verschiedener Zellen herangezogen werden. Die in dieser Studie erstmals etablierte Kultur adh\u00e4renter Zellen auf O2-Sensorplatten erlaubt auch die Bestimmung der Toxizit\u00e4t neuer Wirkstoffe auf unterschiedlichste Zelltypen. \u00dcber die urspr\u00fcnglich vorge-sehenen Arbeiten hinaus wurde eine Medienoptimierungen f\u00fcr CHO in MTP erfolgreich durchgef\u00fchrt. Die Sauerstoffmessung zum metabolischen Abbau von Substraten in MT-Platten mit Sauerstoffsensor zeigte f\u00fcr gepoolte Mikrosomen eine Machbarkeit der Verfolgung der Abbaureaktionen. Gleichzeitig traten auf-grund der unkontrollierten Nebenreaktionen viele St\u00f6rfaktoren auf. Erste orientierende Studien mit isolierten Cyps (z. B. Cyp3A4) deuten auf eine L\u00f6sung unter dem Aspekt der St\u00f6rfaktoren\/Nebenreaktionen hin.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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