Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Der weltweite Pharmamarkt ist eine Wachstumsbranche mit durchschnittlich zweistelligen Zuwachsraten. So stiegen die Ums\u00e4tze in den 13 Schl\u00fcsselm\u00e4rkten in der Zeit von September 2000 bis August 2001 um durchschnittlich 11 % an und erreichten einen Umfang von 248,5 Milliarden US $. Etwa die H\u00e4lfte der weltweit bedeutendsten Medikamente basieren auf Naturstoffen, die Entdeckung wirklich neuartiger Wirkstoffgrundger\u00fcste ist jedoch seit Jahren stark r\u00fcckl\u00e4ufig. Zur Auffindung neuer Substanzklassen ist es daher notwendig alternative Ressourcen zu erschlie\u00dfen. Gleichzeitig ist es im Rahmen eines \u0082sustai-nable development von gro\u00dfem Interesse, bioaktive Sekund\u00e4rstoffe f\u00fcr die Wirkstoffforschung effizient aus regenerativen, biogenen Ressourcen zu gewinnen. Die Untersuchung bislang unbekannter mikrobieller Diversit\u00e4t aus Nischenhabitaten ist daher einerseits ein vielversprechender Ansatz zur Entdeckung neuartiger Wirkstoffgrundger\u00fcste, erlaubt zugleich aber auch eine ressourcenschonende und effizientere Produktion von Wirkstoffen in Fermentationsanlagen, ohne wiederholt auf die meist sensiblen Nischenhabitate zur\u00fcckgreifen zu m\u00fcssen. Im vorliegenden Forschungsvorhaben soll dieser Ansatz mittels konsequenter Anwendung moderner biologischer, genetischer und naturstoffchemischer Verfahren verfolgt werden, um neuartige, bioaktive Sekund\u00e4rmetaboliten aus extremophilen Mikroorganismen zu isolieren und somit eine neue, wertvolle Quelle von Wirkstoffen zu erschlie\u00dfen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAusgehend von den bei den Projektpartnern Prof. Antranikian bzw. Dr. Kletzin vorliegenden Stammsammlungen extremophiler Mikroorganismen als Ressource sollen diese \u00fcber einen dualen Ansatz auf ihre biosynthetischen F\u00e4higkeiten hinsichtlich der Produktion neuartiger Wirkstoffe untersucht werden. Im Wesentlichen sollen einerseits Kultur\u00fcberst\u00e4nde und -extrakte erzeugt werden, um diese mittels Aktivit\u00e4tsprofilierung zu analysieren, andererseits sollen die Isolate selbst durch PCR-Typisierung hinsichtlich des Vorhandenseins von Wirkstoffbiosynthese Genclustern charakterisiert und priorisiert werden. Von biosynthetisch produktiven St\u00e4mmen sollen anschlie\u00dfend aktive Reinsubstanzen isoliert und charakterisiert werden. Um dar\u00fcber hinaus sowohl eine weitere Effizienzsteigerung zu erreichen, als auch in Folge einen umweltentlastenden Effekt bei der chemischanalytischen Darstellung der Wirkstoffe im Produktionsma\u00dfstab zu erzielen, wird die rekombinante Biosynthese der Sekund\u00e4rstoffe in bekannten, hochaktiven Wirkstoffproduzenten (z. B. Streptomyces) angestrebt. Dazu sollen die korrespondierenden Gene f\u00fcr Schl\u00fcsselenzyme bzw. Gencluster f\u00fcr sekund\u00e4rmetabolische Stoffwechselwege dieser extremophilen Mikroorganismen, nach Etablierung geeigneter host \/ Vektorsysteme, als Cosmid- und BAC Expressionsklone gesichert werden, um die Wirkstoffe nachfolgend durch effiziente, heterologe Expres-sion dieser Gencluster in kompetenten Wirtsst\u00e4mmen quantitativ produzieren zu k\u00f6nnen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurden insgesamt 105 Isolate und St\u00e4mme w\u00e4hrend der Hauptprojektphase kultiviert und mittels aktivit\u00e4tsbasierter Assays sowie naturstoff-chemischer Nachweismethoden hinsichtlich ihres Wirkstoffpotenzials analysiert. In antimikrobiellen Agardiffusionstests zeigten 22 % der getesteten St\u00e4mme relevante Aktivit\u00e4ten gegen einen oder mehrere Indikatororganismen, w\u00e4hrend 9 % der St\u00e4mme eine signifikante zelltoxische Wirkung auf CHO-K1 Tumorzellen hatten. Zus\u00e4tzlich zeigten zehn St\u00e4mme chemisch interessante Metaboliten-Spektren. Aufgrund ihres chemisch-biologischen Potenzials wurden 16 Isolate f\u00fcr eine weitere Bearbeitung priorisiert. Priorisierte St\u00e4mme und Isolate wurden in Ma\u00dfst\u00e4ben zwischen 10-L und 50-L fermentiert, um gen\u00fcgend Zellmasse und Substanzmenge f\u00fcr die weiteren Bearbeitungsschritte bereitzustellen. Aus der naturstoffchemischen Bearbeitung dieser St\u00e4mme konnten bislang \u00fcber 80 mit Sekund\u00e4rstoffen angereicherte Fraktionen generiert, 13 Reinstoffe isoliert und 8 Reinstoffe charakterisiert werden. Davon sind drei in ihrer Struktur bereits literaturbekannt. F\u00fcnf Substanzen, niedermolekulare Stoffe mit MR<700, befinden sich in der Strukturaufkl\u00e4rung. Zur effizienten Handhabung der experimentellen Datenmenge wurde eine SQL online-Datenbank programmiert und implementiert, die allen Projektpartnern jederzeit Zugang zu den relevanten, projektspezifischen Daten gibt. F\u00fcr die nachhaltige Produktion biologischer Aktivit\u00e4ten aus priorisierten Isolaten wurde ein flexibles Vektorsystem konstruiert und zur Erstellung von Genbanken bereitgestellt. Ebenso wurde aus 7 der prio-risierten Isolate hochmolekulare, genomische DNA extrahiert. In der zur Verf\u00fcgung stehenden Zeit konnte die genomische Information des priorisierten Isolates 3-015 in einer Fosmid-Genbank (pEpiFOS-5) gesichert werden.\nIm Rahmen der Projektlaufzeit konzentrierten sich die Aktivit\u00e4ten der Projektpartner zun\u00e4chst auf die Kultivierung und das Prim\u00e4rscreening extremophiler Mikroorganismen und im weiteren Verlauf auf die Bearbeitung priorisierter Hitst\u00e4mme nach biologischen und chemischen Gesichtspunkten. Mit den dabei erzielten Ergebnissen konnte das Prim\u00e4rziel des Projekts - also der Nachweis, dass extremophile Mikroorganismen eine interessante Quelle neuer Wirkstoffe darstellen - erbracht werden. \nGleich zu Beginn des Projekts wurde, aufgrund der Neuartigkeit der zu untersuchenden Isolate, der damit verbundenen, m\u00f6glichen Unw\u00e4gbarkeiten in Bezug auf verwendete Assays bzw. chemische Profilierungsans\u00e4tze und aufgrund der Anforderung, auch peptidische Wirkstoffe untersuchen zu wollen, eine Pilotphase durchgef\u00fchrt, die in dieser Form nicht im Projektplan vorgesehen war. Im Rahmen dieser Testphase wurde ein Protokoll zur Herstellung von bioaktiven Rohextrakten etabliert und durch den hohen Anteil antimikrobieller Aktivit\u00e4ten in nachfolgend hergestellten Rohextrakten erfolgreich validiert. Bereits w\u00e4hrend dieser Etablierungsphase wurde klar, dass das geplante Teilprojekt A nicht wie geplant durchf\u00fchrbar sein w\u00fcrde. Urspr\u00fcnglich geplant war eine intensive, stark parallele Kultivierungsphase zur Anzucht und Analyse m\u00f6glichst vieler, der in den Sammlungen existierenden extremophilen MO. Ursache f\u00fcr unsere \u00c4nderung sind die beschriebenen Schwierigkeiten, entweder bei der Reaktivierung der Isolate oder der f\u00fcr eine parallele Kultivierung notwendigen, standardisierten Anzuchtbedingungen. Eine zeitnahe Priorisierung von Hitkandidaten nach erfolgter Durchforstung der Stammsammlungen wurde daher durch eine \u00c4nderungsplanung mit fortlaufender Prim\u00e4rscreeningphase und abschnittsweiser Auswahl auff\u00e4lliger St\u00e4mme und Isolate ersetzt (Auswahlgruppe -1, -2, finale Priorisierung). Auswirkungen hatte dies vor allem auf die Aktivit\u00e4ten des Teilprojekt B, die aufgrund der sehr sp\u00e4ten Priorisierung im letzten Projektab-schnitt komprimiert angegangen werden mussten. Letztendlich gelang es daher in der verbleibenden Pro-jektlaufzeit nicht, die in diesem Teilprojekt geplanten Arbeitspakete vollst\u00e4ndig zu bearbeiten.\nIm Rahmen des zweiten Projektabschnitts konzentrierten sich die Aktivit\u00e4ten der Projektpartner auf die Bearbeitung priorisierter Hitst\u00e4mme nach biologischen und chemischen Gesichtspunkten unter der Anforderung, auch peptidische Wirkstoffe untersuchen zu wollen. Die Wiederfindung der in der Screeningphase aufgefallenen Aktivit\u00e4ten priorisierter St\u00e4mme nach Fermentation verlief erfreulich positiv: so konnten bislang die Aktivit\u00e4ten der St\u00e4mme 3-001, 3-002, 3-009, 0-047 und 1-004 im Extrakt verifiziert werden. Allerdings erwiesen sich die, aus den einzelnen Isolaten darstellbaren, extrem geringen Reinsubstanzmengen als gr\u00f6\u00dfte Herausforderung f\u00fcr einen erfolgreichen Projektabschluss, weil in den aller meisten F\u00e4llen die erforderliche Strukturaufkl\u00e4rung und biologische Testung trotz der aus Eigenmitteln neu gewonnenen Technologie des automatisierten HPLC-DAD-Trenngangs zur Gewinnung von Reinsubstanzen, nicht durchzuf\u00fchren war. Bei der Ursachensuche m\u00fcssen folgende Fragen experimentell untersucht werden, was in dieser Projektlaufzeit nicht m\u00f6glich war:\n1)\tSind die Wirksubstanzen im Extrakt tats\u00e4chlich in derart geringer Menge vorhanden und zeigen trotzdem so starke Aktivit\u00e4t? Dann w\u00e4ren diese Stoffe sehr au\u00dfergew\u00f6hnlich unter den Biotika und von besonders hohem Interesse.\n2)\tSind die Wirksubstanzen chemisch sehr labil, z. B. gegen Luftsauerstoff, acide L\u00f6sungsmittel?\n3)\tSind es nicht die Reinstoffe, die die Wirkung vermitteln, sondern Substanzgemische, so dass bei den aufreinigenden Chromatographieschritten die Wirkung verloren geht?\n4)\tDie au\u00dfergew\u00f6hnlich hohe Polarit\u00e4t vieler Zielverbindungen stellt eine weitere Schwierigkeit dar. Hier m\u00fcssen ver\u00e4nderte Chromatographiesequenzen jeweils individuell neu \u00fcberpr\u00fcft werden.\nDie Zahl der bisher als Reinsubstanzen in ausreichender Menge isolierbaren Wirksubstanzen entspricht daher bisher nicht den Erwartungen. Eine Fermentation im bisherigen Ma\u00dfstab (10 - 50 L) reicht nicht aus, um das Wirkprinzip zu isolieren, in seiner Struktur aufzukl\u00e4ren und biologisch zu testen. Andererseits zeigen einige St\u00e4mme eine derartige F\u00fclle von Verbindungen (z. B. 0-047), dass man sie erfreuli-cherweise als sehr begabte Sekund\u00e4rstoffproduzenten einstufen muss. Sorgf\u00e4ltige, wenn auch zeitintensive Fermentationsoptimierungen k\u00f6nnen hier f\u00fcr eine um das Vielfache h\u00f6here Produktion sorgen. Methoden sind die Zugabe von Polystyrol-XAD-Adsorberharzen oder die Zugabe von Aminos\u00e4uren zur wachsenden Mikroorganismen-Kultur. Gelingt auf diese Weise die Strukturaufkl\u00e4rung neuartiger Wirkstoffe, erlaubt diese m\u00f6glicherweise R\u00fcckschl\u00fcsse auf die Biosynthese der Substanzen und liefert damit die Basis f\u00fcr ein genetisches Screening erstellter Genbanken der priorisierten Isolate. Da der f\u00fcr ein der-artiges F&E-Projekt zur Verf\u00fcgung stehende Zeitrahmen von vorne herein als zu kurz angesehen wurde, m\u00fcssen diese weitergehenden Charakterisierungen, vor allem in den Bereichen nachhaltige Produktion und Substanzentwicklung neu entdeckter Wirkstoffe in einem nachgeschalteten Projekt verst\u00e4rkt angegangen werden. Als Paradebeispiel seien hier die Arbeitsgruppen H\u00f6fle und Reichenbach\/GBF Braunschweig genannt, die erst durch extrem hohen Aufwand (1.000 L-Fermentationen) Wirkstoffe aus Myxo-bakterien isolieren konnten. Die konsequente Weiterf\u00fchrung des Projektansatzes \u00fcber drei Jahrzehnte (!) f\u00fchrte zum weltweit einmaligen Erfolg. Heute gelten Myxobakterien als unerreicht begabte, \u00fcberaus erfolgreiche Wirkstoffproduzenten. Das Epothilon ist als Krebstherapeutikum in Phase II klinischer Pr\u00fcfungen und gilt auf dem Weltmarkt derzeitig als Millionen-Dollar-Naturstoff. Andererseits validieren gerade diese, in der Naturstoffforschung hinl\u00e4nglich bekannten Schwierigkeiten den in diesem Projekt gew\u00e4hlten Ansatz der nachhaltigen Produktion durch heterologe Expression, der gerade auch beim Epothilon erfolgreich umgesetzt werden konnte.\n\n\n\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation\n\nIm Rahmen der vom ICBio koordinierten \u00d6ffentlichkeitsarbeit wurde das Projekt bislang im transkript \nSonderheft \u0082Nachhaltige Biokatalyse (1) und durch einen \u0082flyer zur Biotechnica 2003 vorgestellt. \n(1) Meurer G. Grond S., Kletzin A., Grote R. und Antranikian G. 2003. transkript Sonderband 9: 43-46.\n\n\nFazit\n\nZusammenfassend ist es dem Forschungsverbund in der vergangenen Projektlaufzeit von nur 24 Monaten gelungen, erstmalig die extremophilen Mikroorganismen der unterschiedlichsten Gattungen als Wirkstoffproduzenten mit den modernen Methoden der Projektpartner eingehend zu untersuchen und den Nachweis zu erbringen, dass dieser Mikroorganismengruppe begabte Wirkstoffproduzenten angeh\u00f6ren (proof-of-concept). Erwartungsgem\u00e4\u00df braucht aber der Weg bis zum Mrd.-Dollar-Wirkstoffproduzenten sicher noch eine l\u00e4ngere, intensive Forschungszeit in weitaus gr\u00f6\u00dferen Projektverb\u00fcnden. Hier kann der bestehende Forschungsverbund mit dem Ziel, zun\u00e4chst wenige Produzenten und ausgew\u00e4hlte bioaktive Prinzipien mit der Firma BRAIN in eine industrielle Entwicklung zu bringen, einen ganz entscheidenden Beitrag leisten. Das Konzept zuk\u00fcnftiger Arbeiten des etablierten Verbunds ist bereits erstellt. Dieser Beitrag wird die Wirkstoffforschung und hier vor allem die nachhaltige Produktion von Naturstoffen mit Mikroorganismen und molekularbiologischen Methoden weiter anregen.\nExtrakte extremophiler Mikroorganismen zeigen \u00fcberraschend vielf\u00e4ltige antimikrobielle und zytotoxische Wirkungen, die Anzucht der Organismen und vor allem die Ausbeuten an Reinsubstanzen aus Fermentationen stellen jedoch erwartungsgem\u00e4\u00df eine erhebliche Limitierung dar. Eine nachhaltige Erschlie\u00dfung dieser Ressource muss daher einerseits kurzfristig \u00fcber Gro\u00dffermentationen zur Wirkstoffcharakterisierung und mittel- bis langfristig zur Wirkstoffentwicklung \u00fcber die heterologe Darstellung der Wirksubstanzen in kompetenten Produktionsst\u00e4mmen erfolgen.\n<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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