Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Enzymatische Prozesse, insbesondere stereoselektive Hydrolysen und Synthesen gewinnen in der modernen Feinchemie st\u00e4ndig an Bedeutung, da diese Verfahren zu einer erheblichen Ressourcenschonung und Umweltentlastung f\u00fchren k\u00f6nnen. Trotz gro\u00dfer Fortschritte in der Molekularbiologie und Enzymologie und dem exponentiell wachsenden Verst\u00e4ndnis von Struktur-Aktivit\u00e4tsbeziehungen von Biokatalysatoren, st\u00f6\u00dft die breite Einf\u00fchrung derartiger Verfahren in die industrielle Anwendung aufgrund der Nichtverf\u00fcgbarkeit von gro\u00dfen Sets an Enzymen und deren Bereitstellung in industriell erforderlichen Mengen und Qualit\u00e4ten auf erhebliche Barrieren. Diesen Grundproblemen soll durch die Verf\u00fcgbarmachung neuer und neuartiger Lipasen\/Esterasen in industriekompatiblem Format begegnet und somit der Transfer biokatalytischer Prozesse in nachhaltige industrielle Anwendungen erm\u00f6glicht bzw. beschleunigt werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAls Ressource dient zum einen die bisher wenig erschlossene Biodiversit\u00e4t der nicht-kultivierten Bakterien durch direkte Klonierung der aus Umweltproben isolierten DNA (Metagenom). Die daraus resultierenden Enzyme sollen hinsichtlich ihrer Substratspezifit\u00e4t und insbesondere der Enantioselektivit\u00e4t zun\u00e4chst etwa mit chiralen prim\u00e4ren und sekund\u00e4ren Alkoholen sowie chiralen Carbons\u00e4uren charakterisiert wer-den, die eine Relevanz f\u00fcr die industrielle Anwendung aufweisen. Durch die Etablierung verschiedener Expressionssysteme soll gleichzeitig die Plattform geschaffen werden, um das Auffinden eines effizienten Systems f\u00fcr die pr\u00e4parative Darstellung eines geeigneten Biokatalysators zu beschleunigen. Zum anderen wird die erstmalig klonierte und in reiner Form dargestellte Schweineleberesterase (PLE), welche bislang nur in Form schlecht charakterisierter bzw. reproduzierbarer Rohextrakte verf\u00fcgbar war, als Ausgangspunkt f\u00fcr die Identifizierung neuer industrierelevanter biokatalytischer Prozesse dienen. Hierzu soll die Expression in der Hefe Pichia pastoris optimiert werden bzw. alternative Expressionssysteme eingesetzt werden. Zus\u00e4tzlich werden Mutanten der PLE erzeugt. Die rekombinanten PLEs werden bez\u00fcglich ihres Substratspektrums charakterisiert und f\u00fcr ausgew\u00e4hlte Verbindungen biokatalytische Verfahren entwickelt (z. B. 2-tert-Butylmalons\u00e4ureester als Ausgangssubstanz f\u00fcr die Darstellung von tert-Leucin).<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Projektverlauf wurden alle wichtigen im Projektantrag geplanten Ziele erreicht.
\nDas erste Teilprojekt des Durchmusterns von Plasmid- wie auch Cosmid\/Fosmid-Metagenom-Bankenmittels eines Aktivit\u00e4tstests ist mit der Identifizierung von \u00fcber 500 prim\u00e4ren Kandidaten mit lipolytischer Aktivit\u00e4t erfolgreich abgeschlossen worden. Das zun\u00e4chst gesteckte Projektziel der Erstellung neuer Plasmid-Banken durch den Verbundpartner BRAIN ist dann aufgrund der hohen Zahl an prim\u00e4ren Kandidaten mit lipolytischer Aktivit\u00e4t und der sich abzeichnenden breiten Diversit\u00e4t unter den Enzymen aufge-geben worden. Aus diesem Grund wurden die Arbeiten auf die weiteren Projektziele der Charakterisierung der Enzyme und die Identifizierung der entsprechenden Gene konzentriert. Durch das Auffinden von Esterasen, die Ester terti\u00e4rer Alkohole umzusetzen verm\u00f6gen und f\u00fcr die ein sehr gro\u00dfes industrielles Interesse besteht, konnte ein Schwerpunkt auf das Erstellen einer Enzymbank mit diesen wertvollen Enzymen gelegt werden. Zur schnellen und zuverl\u00e4ssigen Durchmusterung der von Projektpartner BRAIN zur Verf\u00fcgung gestellten Esterasen\/Lipasen als aktiv identifiziert werden. Die erfolgreiche Etablierung der Enantiomerenanalytik durch chirale Gaschromatographie erlaubte eine zeitnahe weitere Charakterisierung der Enzymbank. Folglich sind nunmehr alle relevanten Methoden zur Erreichung eines weiteren wichtigen Ziels des Verbunds etabliert worden: die rasche und zuverl\u00e4ssige Bereitstellung in Bezug auf Substratspektrum und Stereoselektivit\u00e4t charakterisierter Enzymbanken. Mit diesem Portfolio sollte eine Realisierung biokatalytischer Verfahren wesentlich vereinfacht sein, da sowohl die Identifizierung geeigneter Enzyme, die zudem rekombinant herstellbar sind, als auch Substratsynthesen und Informationen zur Aktivit\u00e4t und Stereoselektivit\u00e4t verf\u00fcgbar sind. Im weiteren Verlauf des Vorhabens ist in Anbetracht der gro\u00dfen Zahl bereits gefundener aktiver Esterase\/Lipase-Produzenten und der derzeit laufenden Klonierung und \u00dcberexpression weiterer Biokatalysatoren mit einer ganzen Reihe weiterer Hits (aktive und stereoselektive Enzyme f\u00fcr weitere Substrate) zu rechnen. F\u00fcr die rekombinante Schweineleberesterase konnte durch Herstellung von Mutanten gezeigt werden, dass die Stereoselektivit\u00e4t teilweise erheblich von der Zahl und Art der Mutationen abh\u00e4ngt. Die Entwicklung fermentativer Verfahren (4 bzw. 10 Liter-Ma\u00dfstab) erm\u00f6glicht trotz der niedrigen Expression in der Hefe Pichia pastoris die Bereitstellung aktiver rPLE im Kilo-Unit-Ma\u00dfstab. Zus\u00e4tzlich wurden Verfahren zur Aufarbeitung und Isolierung des Enzyms entwickelt. Ein entscheidender Durchbruch zur Herstellung der rPLE wurde durch die erstmalig erfolgreiche Expression in E. coli erzielt. Damit ist nun eine wesentlich einfachere und kosteng\u00fcnstigere Herstel-lung dieser Carboxylesterase m\u00f6glich.
\nDie Bereitstellung geeigneter Biokatalysatoren, wie sie in diesem Verbundprojekt erreicht wurde, kann somit erheblich zur Einf\u00fchrung neuer biokatalytischer Prozesse beitragen, wenn dadurch das Auffinden eines geeigneten Enzyms erleichtert und die Suche verk\u00fcrzt werden kann. Dar\u00fcber hinaus sind fermentative Verfahren zur Herstellung rekombinanter Enzyme durch \u00dcberexpression wesentlich produktiver im Vergleich zur Kultivierung von Wildst\u00e4mmen, die zudem meist mit einer wesentlich aufw\u00e4ndigeren Aufreinigung verbunden ist. Folglich k\u00f6nnen durch die angestrebten Produktionsmethoden weitere Ressourcen in der Herstellung der Biokatalysatoren eingespart werden.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurde an einer Vielzahl von Fachvortr\u00e4gen auf nationalen und internationalen Kongressen und Messeveranstaltungen zur Verbreitung der Ergebnisse teilgenommen. Darunter sind z. B.: Biocat 2002, Applied Biocatalysis, Osnabr\u00fccker Umweltgespr\u00e4che Nachhaltige Biokatalyse, Metagenomics 2003, BioTrans 2003 und BioTechnica 2003, BioPerspectives 2004<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im gesamten Projektverlauf wurden alle relevanten Methoden zur Erreichung eines wichtigen Ziels des Verbunds etabliert und erfolgreich angewendet: die rasche und zuverl\u00e4ssige Bereitstellung in Bezug auf Substratspektrum und Stereoselektivit\u00e4t charakterisierter Enzymbanken. Mit diesem Portfolio sollte eine Realisierung biokatalytischer Verfahren wesentlich vereinfacht sein, da sowohl die Identifizierung geeigneter Enzyme, die zudem rekombinant herstellbar sind, als auch Substratsynthesen und Informationen zur Aktivit\u00e4t und Stereoselektivit\u00e4t verf\u00fcgbar sind. F\u00fcr die Schweineleberesterase ist insbesondere bei ei-ner Expression ohne Bildung von inclusion bodies mit einer schnellen Realisierung eines Produktionsverfahrens zu rechnen. Damit w\u00e4re die f\u00fcr die organische Synthese wichtigste Esterase in absehbarer Zeit in rekombinanter Form verf\u00fcgbar.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens Enzymatische Prozesse, insbesondere stereoselektive Hydrolysen und Synthesen gewinnen in der modernen Feinchemie st\u00e4ndig an Bedeutung, da diese Verfahren zu einer erheblichen Ressourcenschonung und Umweltentlastung f\u00fchren k\u00f6nnen. Trotz gro\u00dfer Fortschritte in der Molekularbiologie und Enzymologie und dem exponentiell wachsenden Verst\u00e4ndnis von Struktur-Aktivit\u00e4tsbeziehungen von Biokatalysatoren, st\u00f6\u00dft die breite Einf\u00fchrung derartiger Verfahren in […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[63,51,2423,53],"class_list":["post-23066","projektdatenbank","type-projektdatenbank","status-publish","hentry","tag-mecklenburg-vorpommern","tag-ressourcenschonung","tag-umweltkommunikation","tag-umwelttechnik"],"meta_box":{"dbu_projektdatenbank_az_ges":"13071\/01","dbu_projektdatenbank_medien":"","dbu_projektdatenbank_pdfdatei":"A-13071.pdf","dbu_projektdatenbank_bsumme":"458.800,00","dbu_projektdatenbank_firma":"Universit\u00e4t Greifswald\nInstitut f\u00fcr Biochemie\nBiotechnologie & Enzymkatalyse","dbu_projektdatenbank_strasse":"Felix-Hausdorff-Str. 4","dbu_projektdatenbank_plz_str":"17487","dbu_projektdatenbank_ort_str":"Greifswald","dbu_projektdatenbank_p_von":"2002-07-01 00:00:00","dbu_projektdatenbank_p_bis":"2004-06-30 00:00:00","dbu_projektdatenbank_laufzeit":"1 Jahr und 12 Monate","dbu_projektdatenbank_telefon":"03834 86 4367","dbu_projektdatenbank_inet":"www.chemie.uni-greifswald.de","dbu_projektdatenbank_bundesland":"Mecklenburg-Vorpommern","dbu_projektdatenbank_foerderber":"78","dbu_projektdatenbank_ab_bericht":"","dbu_projektdatenbank_ist_nachbewilligung_von":"","dbu_projektdatenbank_hat_nachbewilligung":"","dbu_headerimage_cover":"","dbu_submenu":"","dbu_submenu_position":"","dbu_submenu_entry":[]},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/23066","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/projektdatenbank"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/23066\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":36069,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/23066\/revisions\/36069"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=23066"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=23066"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=23066"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}