Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel des Forschungsvorhabens war die Entwicklung und Bewertung eines technischen Verfahrens zur einfachen und umweltschonenden Abtrennung von Bioprodukten, wie z. B. technisch hergestellten Enzymen, direkt aus feststoffhaltigen Medien \u00fcber an magnetische Mikropartikel gebundene Affinit\u00e4tsliganden und Magnetseparatoren. Weiteres Ziel des Vorhabens war zudem eine direkte biokatalytische Um-setzung von schwerl\u00f6slichen Substraten bzw. von Substraten in Suspensionen und viskosen Medien durch den Einsatz von an magnetischen Mikropartikeln immobilisierten Enzymen und geeigneter Magnettrenntechnologie.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAnhand verschiedener Modellsysteme, wie z. B. immobilisierter Penicillinacylase als industriell intensiv genutztes Enzym oder magnetischen Mikropartikeln mit IMA (immobilised metal affinity) Liganden zur Aufreinigung His-getaggter Proteine, sollte die Leistungsf\u00e4higkeit dieses im industriellen Ma\u00dfstab v\u00f6llig neuen Verfahrens demonstriert werden. Hierbei erfolgten in der Anfangsphase Screeningversuche zur Auswahl geeigneter magnetischer Tr\u00e4gerpartikel und Funktionalisierungsmechanismen. Die Charakterisierung der Partikel umfasste die Partikelgr\u00f6\u00dfenverteilung, mechanische und chemische Stabilit\u00e4t, magnetische Eigenschaften sowie insbesondere die Bindungskapazit\u00e4ten und Selektivit\u00e4ten. Parallel zur Partikelcharakterisierung erfolgte die Konstruktion und Fermentation getaggter Proteine sowie die Konstruktion und Fertigung eines Labor-Hochgradienten-
\nMagnetseparators. Ausgehend von den im Laborma\u00dfstab an den Partikeln gewonnenen Daten wurde das Verfahren mit Hilfe des Simulationsprogramms SuperPro Designer programmiert und f\u00fcr verschiedene Rahmenbedingungen durchgerechnet. Eine Markt-studie und eine Bewertung der Ergebnisse der Experimente und Simulationen erfolgte in Zusammenarbeit mit der DECHEMA. In den sp\u00e4teren Projektphasen standen Fragen des Scale-ups der Partikelproduktion und die Demonstration des Verfahrens im Pilotma\u00dfstab im Vordergrund.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurden zahlreiche wichtige technologische Meilensteine erreicht, die als kritische Schl\u00fcsselpunkte auf dem Weg zur Realisierung des Verfahrens der prim\u00e4ren Proteinaufreinigung mittels Magnetbeads zu sehen sind. Zu den wichtigsten dieser Meilensteine z\u00e4hlen u.a. die Herstellung funktionalisierter Magnetbeads mit hoher Bindekapazit\u00e4t im 50-100 g Ma\u00dfstab, der Nachweis der Wiederverwendbarkeit der Magnetbeads, die Konzeption, Fertigung und Automatisierung einer halbtechni-schen Pilotanlage zur Proteinreinigung, die molekularbiologische Generierung zahlreicher aktiver, getaggter Enzym u. GFP-Varianten, die Demonstration der Proteinaufreinigung mittels Magnetbeads f\u00fcr verschiedene Bioprodukte im Ma\u00dfstab bis zu 16 l ungekl\u00e4rter Rohsuspension sowie schlie\u00dflich die erfolgreiche Immobilisierung, Charakterisierung und Anwendung von Enzymen an Magnetbeads. Die ermittelten Prozessparameter lassen dabei, neben dem \u00fcbergeordneten Ziel einer Umweltentlastung \u00fcber ei-ne Erweiterung der Anwendungsgebiete der Biotechnologie, auch Effekte, wie z. B. die Reduzierung der ben\u00f6tigten Puffermengen oder die Verminderung der Konzentration der ben\u00f6tigten Elutionschemikalien, erkennen, die zu einer direkten Ressourcenschonung in bestehenden Prozessen f\u00fchren k\u00f6nnen.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die folgende Liste gibt eine Auswahl der im Zusammenhang mit dem Projekt bisher erschienenen Ver\u00f6ffentlichungen:
\nFranzreb, M., Ebner, N., Siemann-Herzberg, M. (2003): Magnettechnologie in der Bioproduktaufarbeitung Transkript, Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse, 112-115.
\nMagnetisches Fischen von Biomolek\u00fclen, (2003): Flyer erschienen bei der Deutsche Bundesstiftung Umwelt.
\nRahaus, N. (2003): Einsatz von Magnettrenntechnologie in der Bioproduktaufarbeitung: Aufreinigung von rekombinanten Proteinen am Beispiel des \u0082Green Flurescent Protein (GFP). Diplomarbeit, Institut f\u00fcr Bioverfahrenstechnik, Universit\u00e4t Stuttgart.
\nZissis, S. (2003): Untersuchungen zum Einsatz von Magnettechnologie in der Bioproduktaufarbeitung Diplomarbeit, Institut f\u00fcr Technische Chemie, Wasser- und Geotechnologie, Forschungszentrum Karlsruhe.
\nSchultz, N. (2003): Application of magnetic separation technology for purification and immobilisation of recombinant enzymes; Poster auf der European Conference of Biotechnolgy, 24.-29.08.2003, Basel, Switzerland.
\nFranzreb, M. (2004): Direct capture of proteins from unclarified feedstocks by magnetic separation technology, Executive Summary anl\u00e4sslich der 5. Baesweiler BioTec Tage, Baesweiler, 01.10.2004.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Rahmen des Projekts wurden gro\u00dfe Fortschritte auf dem Weg zur technischen Umsetzung der Verfahren der Proteinreinigung bzw. Biokatalyse mit Hilfe von Magnetbeads erreicht. Der realisierte Ma\u00dfstab der Pilotanlage zur Proteinreinigung liegt mit dem Einsatz von 100 g Magnetbeads pro Zyklus und bearbeiteten Suspensionsvolumen bis \u00fcber 15 l um mehr als eine Gr\u00f6\u00dfenordnung \u00fcber s\u00e4mtlichen bisher in der Literatur beschriebenen Anwendungen von Magnetbeads in der Biotechnologie. Zudem wurde in der Pilotanlage ein Automatisierungsgrad erreicht, der dem industrieller Prozesse entspricht und damit s\u00e4mtliche daraus resultierende Herausforderungen vorwegnimmt. Ausgehend von einem Biofeedstock, wie z. B. einem ungekl\u00e4rten Zellhomogenisat, liefert die Pilotanlage einen feststofffreien und zu ca. 70-95 % reinen Produktstrom. Die experimentellen Ergebnisse sowie theoretische \u00dcberlegungen zeigen, dass sich das Verfahren der prim\u00e4ren Proteinreinigung mittels Magnetbeads am besten f\u00fcr Zielproteinkonzentrationen im Ausgangsmedium von ca. 0,1 1 g\/l eignet.
\nIm Bereich der Biokatalyse konzentrierten sich die Arbeiten \u00fcberwiegend auf die Erarbeitung effizienter Immobilisierungstechniken f\u00fcr Enzyme an Magnetbeads und auf den Nachweis der postulierten Vorteile unpor\u00f6ser Mikrotr\u00e4ger im Vergleich zu makropor\u00f6sen, konventionellen Tr\u00e4germaterialien. Unter Einsatz des Spacers Hexamethylendiamin konnten im Falle der Penicillinamidase (PA) Enzymbeladungen bis \u00fcber 50 mg\/g Beads erreicht werden, wobei 80-90 % des gebundenen Enzyms aktiv waren. In anschlie\u00dfenden Biotransformationsversuchen, u. a. zur Stereoselektivit\u00e4t, zeigte sich dass die Eigenschaften der an Mikrotr\u00e4ger immobilisierten PA zwischen denen der freien PA und denen von an makropor\u00f6sen Tr\u00e4gern immobilisierter PA liegen. Hierdurch best\u00e4tigt sich, dass die Biotransformation mittels Mikro-Immobilisaten praktisch keinen Transporteffekten, wie z. B. einer unerw\u00fcnschten pH-Verschiebung innerhalb des Tr\u00e4gers, unterliegt.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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