Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel des Projekts ist es, die effiziente enzymatische Produktion sowohl bereits bekannter als auch neuartiger Oligo- und Polysaccharide sowie funktioneller Fructoside mittels neuer Glykosyltransferasen des Nicht-Leloir-Typs zu erm\u00f6glichen. Ausgangssubstrat f\u00fcr diese Enzyme ist die aus nachwachsenden Roh-stoffen in gro\u00dfer Menge vorhandene Saccharose. Diese neuen Glykosyltransferasen k\u00f6nnen dann ge-zielt zur ressourcenschonenden enzymatischen Herstellung neuartiger Oligosaccharide und Zuckerderivate in der Lebensmittel- und Pharmaindustrie eingesetzt werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAusgehend von literaturbekannten Glykosyltransferasenproduzenten (Acetobacter diazotrophicus, Rahnella aquatilis), die als Positivkontrollen zur Entwicklung eines selektiven Fructosyltransferase-Assays dienen, wurde ein spektrophotometrischer Assay zum schnellen, qualitativen, direkten Nachweis gebildeter Oligo- und\/oder Polysaccharide im Mikrotiterplattenformat entwickelt. Mittels dieses Assays wurden verschiedene Habitate (diverse B\u00f6den, pflanzliches Material) auf Mikroorganismen mit Fructosyltransferaseaktivit\u00e4t hin gescreent. Um ein Vergleichsenzym aus Rahnella aquatilis verf\u00fcgbar zu machen, wurde das Levansucrasegen heterolog in Escherichia coli exprimiert. Aus dem Screening wurde Gluconobacter cerinus als neuer Fructosyltransferaseproduzent ausgew\u00e4hlt und im 4 L-Ma\u00dfstab kultiviert.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Bei der Kultivierung von Rahnella aquatilis im 10 L-Ma\u00dfstab konnte die Biomasseausbeute im Vergleich zur Literatur (Ohtsuka, et al., Biosci. Biotech. Biochem., 56 (9), 1992) um den Faktor 33 gesteigert wer-den. Die von Ohtsuka et al. (1992) angegebenen Aktivit\u00e4ten konnten nicht reproduziert werden. Es wur-den lediglich 5 % der von Ohtsuka et al. (1992) erzielten Aktivit\u00e4t erhalten. Es zeigte sich bei der Kultivie-rung, dass durch die Bildung von Levan die Gewinnung der Biomasse und die nachfolgende Gewinnung und Aufreinigung der Levansucrase so erschwert wurden, dass dieser Ansatz nicht weiter verfolgt wurde.
\nUm das Referenzenzym f\u00fcr weitergehende Untersuchungen zur Verf\u00fcgung zu stellen, wurde das Levansucrasegen heterolog in Escherichia coli exprimiert. Zur Erleichterung der Aufreinigung wurde ein His-Tag angef\u00fcgt. Es wurden 52 \u00b5kat Fructosyltransferaseaktivit\u00e4t1 aus 1,9 g Biotrockenmasse erhalten. Die Aufreinigung erfolgte mittels Nickelchelataffinit\u00e4tschromatographie. Die Aktivit\u00e4tsausbeute betrug 90 %, der Aufreinigungsfaktor 21.
\n323 St\u00e4mme aus verschiedenen Habitaten waren auf Fructosyltransferaseaktivit\u00e4t hin gescreent worden. 27 wurden als Fructosyltransferaseproduzenten identifiziert. F\u00fcr weitere Untersuchungen wurde daraus Gluconobacter cerinus ausgew\u00e4hlt. Gluconobacter cerinus wurde im 4 L-Ma\u00dfstab zur Gewinnung der Levansucrase kultiviert. Dabei wurden bei der Kultivierung mit 50 g Mannit\/L und 2 g Saccharose\/L zur Induktion des Enzyms 220 \u00b5kat Fructosyltransferase aus 3 L Kultur erhalten, wobei 46 % der Aktivit\u00e4t extrazellul\u00e4r vorlagen. Dies entspricht ei-ner gesamthydrolytischen Aktivit\u00e4t2 von 101 \u00b5kat\/L Kultur. Bei einer analog durchgef\u00fchrten Kultivierung mit 50 g Mannit\/L und 20 g Saccharose\/L wurden 140 \u00b5kat Fructosyltransferase aus 3 L Kultur erhalten, wobei 79 % der Aktivit\u00e4t extrazellul\u00e4r war, entsprechend 54 \u00b5kat gesamthydrolytische Aktivit\u00e4t\/L Kultur.
\nGluconobacter cerinus war bislang nicht als Fructosyltransferaseproduzent beschrieben worden. Eliashvili (Mikrobiologiya, 50 (1), 1981) hatte 1981 beschrieben bei einer Kultivierung von Gluconobacter oxydans mit 15 g Mannit\/L ohne Saccharose insgesamt 73 \u00b5kat gesamthydrolytische Aktivit\u00e4t\/L Kultur\u00fcberstand erhalten zu haben.11 nkat Fructosyltransferaseaktivit\u00e4t ist definiert als Stoffmengendifferenz aus der w\u00e4hrend der Biotransformation freigesetzten Glucose minus der freigesetzten Fructose in nmol pro Sekunde.21 nkat entspricht der Freisetzung von 1 nmol Glucose aus Saccharose in 1 Sekunde.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Bisher:Koslik, H.; Lutz-Wahl, S.; Fischer, L.: Neue Glykosyltransferasen f\u00fcr lebensmitteltechnologische Anwendungen Levansucrase aus Rahnella aquatilis ATCC 33071 – Referenzenzym f\u00fcr die Assayentwicklung, Posterpr\u00e4sentation, Dechema 2002, Wiesbaden.
\nKoslik, H., Lutz-Wahl, S., Fischer, L.: New fructosyltransferases for potential industrial applications.
\nPosterpr\u00e4sentation, 6th International Symposium on Biocatalysis and Biotransformations, 2003, Olomouc, Tschechien.
\nPublikationen in Peer-Review Journalen (in Vorbereitung):1) Semiautomated screening for new microbial fructosyltransferase producers2) Production and partial characterization of a new fructosyltransferase from Gluconobacter cerinus<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Das Referenzenzym aus Rahnella aquatilis konnte rekombinant in ausreichender Menge f\u00fcr weitere Untersuchungen verf\u00fcgbar gemacht werden. Die Kultivierung des Wildstamms zur Gewinnung des Refe-renzenzyms erwies sich aufgrund des gebildeten Levans als ungeeignet.
\nDas in diesem Projekt entwickelte Screening-Verfahren ist zur schnellen \u00dcberpr\u00fcfung von Mikroorganismen auf Fructosyltransferaseaktivit\u00e4t geeignet.
\nBei der Kultivierung des neuen Fructosyltransferaseproduzenten Gluconobacter cerinus waren zun\u00e4chst Schwierigkeiten hinsichtlich der Biomasseausbeute aufgetreten. Durch Kultivierung mit Mannit als Kohlenstoffquelle und Saccharose zur Enzyminduktion konnte ausreichend Biomasse bzw. extrazellul\u00e4res Enzym f\u00fcr weitere Untersuchungen erhalten werden. Aufgrund der anf\u00e4nglichen Schwierigkeiten bei der Kultivierung war es bislang noch nicht m\u00f6glich, die Fructosyltransferase aus Gluconobacter cerinus auf-zureinigen und detaillierter zu charakterisieren.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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