Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Industriell realisierte biokatalytische Verfahren zeichnen sich im Vergleich zur chemischen Synthese durch einen geringeren Energieverbrauch aus, sind zielgerichteter (weitgehende Vermeidung von Neben- und Abfallprodukten) und ressourcenschonender. Die Fortschritte in der biotechnologischen Grundlagenforschung und -anwendung erlauben es heute, Stoffwechselwege gezielt so zu ver\u00e4ndern, dass nat\u00fcrliche (aber auch nichtnat\u00fcrliche) Produkte wie beispielsweise \u0082chiral building blocks (Jahresumsatz ~ 2 Mrd. US$) mit h\u00f6heren Ausbeuten und Selektivit\u00e4ten hergestellt werden k\u00f6nnten. Damit k\u00f6nnte die chemische asymmetrische Synthese, die unter hohem Druck und hohen Temperaturen, bei Verwendung von giftigen Schwermetallkatalysatoren sowie gro\u00dfer Mengen organischer L\u00f6sungsmittel durchgef\u00fchrt wird, zunehmend zur\u00fcckgedr\u00e4ngt werden.
\nDas Kernproblem ist gegenw\u00e4rtig jedoch die z\u00fcgige Umsetzung dieser Potenziale in industrielle Produktionsverfahren. Hierzu werden oftmals bis zu 10 Jahre und mehr ben\u00f6tigt. Die heutige sequenzielle Vorge-hensweise (Biokatalysatorentwicklung im Hochdurchsatzverfahren – Bioprozessentwicklung im Laborbioreaktor – \u00dcberf\u00fchrung in den Produktionsma\u00dfstab) f\u00fchrt sogar dazu, dass viele potenzielle biokatalytische Ans\u00e4tze bereits in einer sehr fr\u00fchen Entwicklungsphase nicht weiter verfolgt werden. Dies gilt besonders, wenn mit den bestehenden Paralleltechniken (Mikrotiterplatten, Sch\u00fcttelkolben) das Potenzial nicht erkannt werden kann oder aufgrund des enormen Zeit- und Personalaufwands bei der nachfolgenden Prozessentwicklung im Laborbioreaktor nur wenige Biokatalysatoren intensiver untersucht werden k\u00f6nnen.
\nZielsetzung dieses Forschungsvorhabens ist die Bereitstellung der wissenschaftlich-technologischen Grundlagen zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung: Hierzu soll ein Modul mit 48 R\u00fchrkesselreaktoren im 5 ml-Ma\u00dfstab als \u0082Bioreaktorblock entwickelt, mit paralleler nicht-invasiver Optosensorik zur online pH- und pO2-Messung ausgestattet und mit einem Labor-Roboter automatisiert werden, um sowohl Stamm- als auch Prozessentwicklung zeiteffektiv unter kontrollierten Reaktorbedingungen durchf\u00fchren zu k\u00f6nnen. Zur biotechnologischen Evaluierung sollen E. coli und S. cerevisiae als Modellsysteme eingesetzt und beispielhaft durch Optimierung der Reaktionsbedingungen im Parallelansatz die NAD(P)-Gehalte in den Zellen maximiert werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenBioreaktorblock
\n(H+P) Entwicklung eines sterilisierbaren Multireaktoreinsatzes f\u00fcr einen induktiven Multimagnetantrieb f\u00fcr 48 \u0082ml-Bioreaktoren in Form eines Bioreaktorblocks, der zun\u00e4chst simultan in allen Bioreaktoren Drehzahlen von bis zu 2500 rpm erm\u00f6glicht.
\n(TUM) Entwicklung eines gasinducing Magnetr\u00fchrorgans zur axialen F\u00f6rderung von der Fl\u00fcssigkeitsoberfl\u00e4che zum Boden des Reaktionsgef\u00e4\u00dfes (\u0082Einsaugen der Gasphase) und effektive Dispergierung der Gasphase in m\u00f6glichst kleine Gasblasen mit hoher Stoffaustauschfl\u00e4che (hohe lokale Energiedissipation) sowie Quantifizierung der Sorptionseigenschaften (kLa-Messungen mit miniaturisierter Sauerstof-foptode).
\nParallele Optosensorik (Sensorblock)
\n(PreSens) Entwicklung eines modularen \u0082Optik-Untersetzers zum individuellen Auslesen der beiden optischen Sensoren (pH oder pO2) jedes \u0082ml-Bioreaktors. Realisierung eines 2-Kanalprototypen.
\n(PreSens) Entwicklung einer zentralen Steuereinheit zum Auslesen von 48 parallelen 2-Kanal-Optik-Untersetzer (zentrale Phasendedektionseinheit). Realisierung eines 2×2-Kanalprototypen.
\nAutomatisierung mit einem Pipettier-Roboter
\n(DASGIP) Entwurf des leittechnischen Ansatzes zur Automatisierung der Parallelreaktoren mit Hilfe eines Labor-Roboters als Aktor (Programmierung der Schnittstelle Pipettier – Leitsystem, Entwicklung und Rea-lisierung der Schnittstelle Optoelektronik – Leitsystem).
\n(DASGIP) Erste Implementierung (rapid-prototyping) einer parallelen Dosiersteuerung mit Hilfe des Pipettier-Roboters als Aktor.
\nBiotechnologische Evaluierung
\n(TUM) Parallele Messung von pH und pO2 mit optisch beschichteten Parallelreaktoren im Bioreaktorblock und Monitoring von pH und pO2 im Parallelansatz bei der Kultivierung von Escherichia coli bzw. Saccharomyces cerevisiae im Bioreaktorblock; erste Parallelans\u00e4tze zur Maximierung der NAD(P)-Gehalte in diesen Mikroorganismen durch Optimierung der Reaktionsbedingungen. Durch h\u00f6here NAD(P)-Konzentrationen in Hefezellen soll zum einen die NAD-Herstellung \u00f6konomisch und \u00f6kologisch verbessert werden (h\u00f6here Ausbeuten verringern die Abwasser- und Abfallmengen). Zum anderen kann durch den Verzicht auf eine NAD(P)-Zugabe bei Ganzzell-Reduktionen die \u00d6konomie so weit verbessert werden, dass mehr biokatalytische Prozesse zur Darstellung chiraler Alkohole industriell umsetzbar sind als bisher und damit die entsprechenden umweltbelastenden chemischen asymmetri-schen Synthesen ersetzt werden k\u00f6nnen.
\nMit Hilfe der Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung soll zuk\u00fcnftig ein Quantensprung in der Effektivit\u00e4t der Bioprozessentwicklung erm\u00f6glicht, die heutige sequenzielle Arbeitsweise weitgehend \u00fcberwunden und neue Wege zur verfahrenstechnischen Optimierung biotechnologischer Prozesse er\u00f6ffnet werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
n<\/p>\n
Bioreaktorblock
\n(H+P) Entwicklung eines Bioreaktorblocks f\u00fcr 48 ml-Bioreaktoren mit integriertem induktiven Multimag-netantrieb: Der Prototyp des Reaktionsblocks ist fertig gestellt und befindet sich bei TUM im Einsatz.
\n(TUM) Entwicklung und verfahrenstechnische Charakterisierung der Sorptionseigenschaften eines schwebenden Gas induzierenden Magnetr\u00fchrorgans: Es werden mit Gas induzierenden R\u00fchrsystemen im mL-Ma\u00dfstab ausreichend hohe kLa-Werte von bis zu 0,4 s-1 erreicht.
\n(H+P) Entwicklung einer sterilen, konvektiv durchstr\u00f6mten Abdeckung der mL-Bioreaktoren mit sterilem Zugang zum automatisierten Fl\u00fcssigkeitstransfer mit einem Pipettierautomaten: Der Prototyp der Sterilabdeckung ist fertig gestellt und befindet sich bei TUM im Einsatz.
\nParallele Optosensorik (Sensorblock)
\n(PreSens) Entwicklung eines 1-Kanal Messger\u00e4teprototyps f\u00fcr pH- bzw. pO2-Sensor: Kultivierungen mit E. coli im mL-Ma\u00dfstab mit Referenzmessungen (TUM) zeigten keine Abweichungen beim pO2. Die Abweichungen beim pH sind kleiner 0,1.
\n(PreSens) Entwicklung eines nebeneinander liegenden 2×2-Kanal Prototypen zur parallelen Messung von pH und pO2: Es wurde statt eines 2×2- bereits ein 8×8-Kanal Prototyp gefertigt und TUM wie geplant am Ende des Projekts f\u00fcr erste Messungen zur Verf\u00fcgung gestellt.
\n(TUM) Parallele Messung von pH und pO2 mit optisch beschichteten Parallelreaktoren im Bioreaktor-block: Kultivierungen mit Escherichia coli best\u00e4tigen die Funktionsf\u00e4higkeit des Messsystems bereits f\u00fcr pO2.
\nAutomatisierung mit einem Pipettier-Roboter
\n(DASGIP) Entwurf und erste Implementierung des leittechnischen Ansatzes zur Automatisierung der Parallelreaktoren mit Hilfe eines Labor-Roboters als Aktor: Die Ansteuerung der pH-, und pO2- Sensorik ist voll funktionsf\u00e4hig.
\n(DASGIP) Erste Implementierung einer parallelen Dosiersteuerung mit Hilfe des Pipettierautomaten als Aktor: Erste Testl\u00e4ufe der parallelen Dosiersteuerung bei TUM.
\nBiotechnologische Evaluierung
\n(TUM) Erste Kultivierungen von Escherichia coli im Bioreaktorblock: Im Zulaufverfahren k\u00f6nnen nach einer Prozesszeit von 20 Stunden Zelldichten von \u00fcber 20 g L-1 Biotrockenmasse erreicht werden. Der Prozessverlauf ist analog zum Referenzverfahren im 3 L R\u00fchrkesselreaktor.
\n(TUM) Erste reaktionstechnische Untersuchungen im Parallelansatz zur Erh\u00f6hung des NAD(P)+-Gehalts in Saccharomyces cerevisiae: Die Zugabe von kosteng\u00fcnstig verf\u00fcgbaren Vorl\u00e4ufermetaboliten der NAD(P)+-Biosynthese f\u00fchrt zu erh\u00f6hten NAD(P)+-Gehalten. Mit solchen Zellen konnten h\u00f6here Ausbeuten bei der asymmetrischen Synthese von (S)-4-Chlor-3-Hydroxybutters\u00e4ureethylester erzielt werden.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
–\tPuskeiler, R., Zacher, K., Ducret, A., Weuster-Botz, D.: Stirred-tank bioreactors at mL-scale. Vor-trag 21. DECHEMA Jahrestagung der Biotechnologen, 02.-04.04.2003, Garching.
\n–\tPuskeiler, R., Weuster-Botz, D.: Exponat \u0082Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung, 21. DECHEMA Jahrestagung der Biotechnologen, 02.-04.04.2003, Garching.
\n–\tPuskeiler, R., Weuster-Botz, D.: Vortrag mL-scale bioreactors as a tool for process design. Vortragstagung des GVC-Fachausschusses Bioverfahrenstechnik und des DECHEMA-Arbeitsausschusses Technik biologischer Prozesse, 26.-28.05.2003, Bad D\u00fcrkheim.
\n–\tPuskeiler, R., Weuster-Botz, D.: Stirred-tank bioreactors at mL-scale. Vortrag BASF AG, 08.07.2003, Ludwigshafen.-\tPuskeiler, R., Zacher, K.-H., Ducret, A., Weuster-Botz, D.: Poster Parallel stirred bioreactors at mL-scale for high throughput bioprocess design. European Conference on Biotechnology 11, 24.-29.08.2003, Basel.
\n–\tWeuster-Botz, D., Puskeiler, R.: Parallelbioreaktoren zur Hochdurchsatz Proteinexpression. Vortrag Deutsches Krebsforschungszentrum (DKFZ), 17.09.2003, Heidelberg.
\n–\tWeuster-Botz, D., Puskeiler, R.: Parallelreaktoren f\u00fcr Ganzzellbiokatalysatoren. Vortrag VAAM-Sommerschule Biokatalyse, 18.09.2003. Bad Herrenalb.
\n–\tWeuster-Botz, D., Puskeiler, R., Kaufmann, K., John, G., Arnold, M. (2003): Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung. Transkript, Sonderband Nachhaltige Biokatalyse: 55-58.
\n–\tPuskeiler, R., Weuster-Botz, D.: Exponat \u0082Bioreaktorblock, DBU-Pr\u00e4sentation auf der Biotechnica 2003, 07.-09.10.2003, Hannover.
\n–\tWeuster-Botz, D., Puskeiler, R.: Neue Ans\u00e4tze zur Hochdurchsatz-Bioprozessentwicklung. Vortrag DECHEMA, 29.10.2003, Frankfurt.
\n–\tPuskeiler, R.: Parallel bioreactors for bioprocess development. BioPerspectives 2004, 04.-06.05.2004, Wiesbaden.
\n–\tPuskeiler, R., Kusterer, A., Weuster-Botz, D.: Development of parallel-operated mL-scale bioreactors for bioprocess design. GVC\/DECHEMA Vortrags- und Diskussionstagung Simultane und integrierte Bioprozessentwicklung, 17.-19.05.2004, Eisenach.
\n–\tPuskeiler, R., Kaufmann, K., Weuster-Botz, D. (2004): Development, parallelization and automation of a gas-inducing mL-scale bioreactor for high-throughput bioprocess design (HTBD). Biotechnol Bioeng, accepted.
\n–\tPuskeiler, R., Weuster-Botz, D. (2004): R\u00fchrkesselreaktoren im mL-Ma\u00dfstab: Kultivierung von E-scherichia coli. Chemie Ingenieur Technik, akzeptiert.
\n–\tPuskeiler, R., Kusterer, A., John, G., Weuster-Botz, D. (2005): Miniature bioreactors for automated high-throughput bioprocess design (HTBD): Comparability of parallel cultivations with Escherichia coli. Biochem Eng J, submitted.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Projektverlauf konnten alle Projektziele und Meilensteine fristgerecht verwirklicht werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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