Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Die \u00dcberexpression in pflanzlichem Gewebe (molecular farming) erm\u00f6glicht die Entwicklung eines biotechnologischen Verfahrens zur nachhaltigen Produktion antimikrobieller Peptide – bei verringertem Energieeinsatz und gleichzeitig verbesserter Produktqualit\u00e4t. Dar\u00fcber hinaus k\u00f6nnen aber auch andere Biopharmazeutika umweltschonend im pflanzlichen System hergestellt werden. Die Planton GmbH plant, die im Rahmen des Projektvorhabens erzeugten Substanzmengen f\u00fcr erste pr\u00e4klinische Studien einzusetzen, um somit die Entwicklung von HBD-2 und HBD-3 zu einem Medikament zu erzielen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenAntimikrobielle Peptide sind eine neue Klasse antibiotisch wirksamer Substanzen, die eine vielversprechende Alternative zu herk\u00f6mmlichen Antibiotika darstellen. Ziel des hier beantragten Projekts ist die Entwicklung eines ressourcen- und umweltschonenden Verfahrens zur Produktion der humanen antimikrobiellen Peptide HBD-2 und HBD-3, die der Klasse der \u00df-Defensine angeh\u00f6ren. Zur Nutzung dieser Peptide f\u00fcr die Entwicklung einer neuen Generation von antibiotisch wirksamen Medikamenten in der klinisch-pharmazeutischen Praxis bedarf es gro\u00dfer Mengen (kg bis to-Mengen) dieser Substanz. Die Isolation der Peptide aus humanem Gewebe liefert keine ausreichenden Mengen und ist aus medizinischen wie ethischen Gr\u00fcnden problembehaftet. Die gro\u00dftechnische Gewinnung mittels gentechnischer Methoden in Fermentationsanlagen ist teuer (> 1000 US$ pro mg in S\u00e4ugetierzellkultursystemen) und energetisch aufw\u00e4ndig (Zellen m\u00fcssen gef\u00fcttert und temperiert werden, Anlagen m\u00fcssen sterilisiert werden). Au\u00dferdem ist die Produktion in mikrobiellen Systemen aufgrund der antimikrobiellen Aktivit\u00e4t des Molek\u00fcls problematisch. Der methodische Ansatz zielt auf die Erzeugung gentechnisch ver\u00e4nderter Pflanzen ab, die gezielt in definierten Organen und subzellul\u00e4ren Kompartimenten rekombinantes \u00df-Defensin pro-duzieren. Dazu soll im Rahmen des beantragten Vorhabens ein optimiertes Expressionssystem entwi-ckelt werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Rahmen des vorliegenden Projekts sollten zwei Ziele verfolgt werden. Erstens die Entwicklung und Optimierung eines ressourcenschonenden und nachhaltigen pflanzlichen Produktionsverfahrens f\u00fcr antimikrobielle Peptide humanen Ursprungs und zweitens die Verwendung erster Substanzmengen zur Bestimmung der antimikrobiellen Aktivit\u00e4t der neu produzierten rekombinanten Molek\u00fcle. Um diese Ziele zu realisieren, wurden f\u00fcnf Arbeitspakete (AP) geschn\u00fcrt:
\nArbeitspaket 1: Aufbau neuer Expressionskassetten
\nEs wurden 26 Expressionskassetten kloniert, in den bin\u00e4ren Vektor inseriert und in die Kartoffel transfor-miert (Meilenstein 1 erreicht).
\nArbeitspaket 2: Identifizierung neuer Promotoren
\nEs wurde eine Mutanten-Kollektion aus Kartoffelpflanzen, die mit einem promotorlosen GUS-Gen transformiert wurde, etabliert, um neue knollen- und artspezifische Promotoren zu selektieren. Hierzu wurden ca. 2000 transgene Linien erzeugt, die mittels GUS-Test und molekularer Methoden analysiert wurden. Es konnten Kandidatensequenzen isoliert werden, von denen zurzeit genomische Klone >1kb isoliert werden. Beim Aufbau der Expressionskassetten konnte ein artfremder Promotor selektiert werden (PlantonPro1), der eine 10-100fach h\u00f6here Expression als der 35S-Promotor aus dem CaMVirus und dar\u00fcber hinaus eine knollenspezifische Aktivit\u00e4t aufweist. Aufgrund dieser Tatsache wurde die Anzahl der erstell-ten Kartoffellinien nicht weiter erh\u00f6ht (Meilenstein 2 weitgehend erreicht).
\nArbeitspaket 3: Erstellung transgener Pflanzen
\nJe Konstrukt wurden mindestens 50 transgene Kartoffellinien erzeugt. Ann\u00e4hernd die gleiche Anzahl wurde im Gew\u00e4chshaus angezogen und die Knollen geerntet Die erstellten Pflanzen zur Produktion der rekombinanten Defensine wurden per Western- und ELISA-Analyse untersucht, um ihren Gehalt an rekombinantem Protein zu bestimmen. Dabei wurde ein Genotyp mit einer Expression von etwa 10 30 mg f\u00fcr das antimikrobielle Peptid HBD-2 je kg Kartoffelknolle selektiert (Meilenstein erreicht).
\nArbeitspaket 4: Aufreinigung der rekombinanten Peptide aus den Pflanzen
\nDer in Arbeitspaket 3 selektierte Genotyp wird f\u00fcr die von der Firma PLANTON entwickelte gro\u00dftechnische Aufreinigung von HBD-2 verwendet. Ein effizienter Aufreinigungsprozess wurde etabliert, in dem das HBD-2 mit einer hohen Reinheit (> 97 %) aus der Knolle extrahiert wird (Meilenstein erreicht). Die Aufreinigung f\u00fcr das HBD-3 Peptid konnte nicht realisiert werden. Es wurden jedoch transgene, HBD-3 exprimierende Pflanzen erzeugt, deren Analyse noch nicht abgeschlossen ist.
\nArbeitspaket 5: Antimikrobielle Tests mit den rekombinanten Peptiden
\nDie weitere Aufreinigung erfolgte beim Projektpartner II, der mit dem hochreinen HBD-2 Peptid die antimikrobiellen Tests etablierte und durchf\u00fchrte (Meilenstein erreicht). Die ersten Testergebnisse zeigten, dass rekombinantes HBD-2 vorwiegend gegen humanpathogene gramnegative Bakterien und gegen Pilze wirkt. Eine Wirkung bei grampositiven Keimen erfolgte offensichtlich nur bei einer sehr hohen Konzentration. Erstaunlicherweise zeigte sich eine sehr starke Wirkung gegen Acinetobacter, der ein Problemkeim insbesondere auf Intensivstationen und damit bei nosokomialen Infekten ist. Ein System f\u00fcr antimikrobielle Tests von \u00df-Defensin-3 wurde ebenfalls durch Projektpartner II entwickelt (Meilenstein er-reicht).<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Ver\u00f6ffentlichungen
\n–\tin Vorbereitung f\u00fcr Nature Biotechnology: Expression of recombinant human \u00df-Defensin (HBD-2) in potato tubers effective against multidrug resistant microbes
\n–\tFAZ, Sonderbeilage Biotechnologie, 07.10.2003
\n–\tTranskript, Sonderband Nachhaltige Biokatalyse 2003
\n–\tErnst & Young, Biotechnologie Report Zeit der Bew\u00e4hrung 2003
\nFachvortr\u00e4ge
\n19.09.02\t Biotech Corporation, Schwedisches Generalkonsulat, Hamburg
\n23.09. – 25.09.02\tBotanikertagung Freiburg
\n28.10.02\t\t Dechema Regional-Kolloquium, Luckenwalde, Neue Protein-Expressionssysteme f\u00fcr die Biotechnologie und Medizin
\n28.11.02\t HiTechTage, Hamburg
\n21.05. – 23.05.03\tAchema, Frankfurt
\n30.11. – 03.12.04\tNatural Peptides to Drugs, Zermatt, Schweiz
\nMessen, Konferenzen
\n30.09. – 01.10.02\tEuropean Biotechnology Symposium, M\u00fcnchen
\n16.03. – 19.03.03\tConference on Plant Made Pharmaceuticals, Qu\u00e9bec, Kanada
\n27.04. – 02.05.03\t4th International Gordon Research Conference on Antimicrobial Peptides, Il Ciocco, \tBarga, Italien
\n22.06. – 25.06.03\tBio2003, Washington, USA
\n07.10. – 09.10.03\tBiotechnica, Hannover
\n20.10. – 21.10.03\tBMBF-Biotechnologie-Tage, Leipzig
\n08.12.03\t 1. Planton Symposium \u00fcber HBD-2, Kiel
\n06.06. – 09.06.04\tBio2004, San Francisco, USA<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die Optimierung der HBD-2 Produktion wird auf dem eingeschlagenen Weg fortgesetzt. Dar\u00fcber hinaus war die Expression von HBD-3 in Pflanzen ein wichtiger Schwerpunkt f\u00fcr die Endphase des Projekts. Wie im Ergebnisteil beschrieben, konnte eine HBD-3 Expression in den erstellten Kartoffellinien nachgewie-sen werden. Erste Ergebnisse mit diesem Molek\u00fcl, das aus menschlichem Gewebe aufgereinigt wurde, zeigten, dass das Molek\u00fcl eine starke Aktivit\u00e4t gegen grampositive Keime aus\u00fcbt und damit HBD-2 her-vorragend erg\u00e4nzt. Gleichzeitig ist dieses Molek\u00fcl allerdings wesentlich kationischer (pI 11) als HBD-2, worauf sich sicherlich ein Gro\u00dfteil der Schwierigkeiten bei der heterologen Expression und der Identifikation zur\u00fcckf\u00fchren lassen. Bei HBD-3 handelt es sich um einen potenziellen Wirkstoff, der vor allem im to-pischen Anwendungsbereich gegen grampositive Keime ein gro\u00dfes Marktpotenzial besitzt.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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