Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Mit Hilfe k\u00e4lteaktiver Lipasen oder Esterasen soll ein nachhaltig umweltgerechtes Verfahren zur Darstellung enantiomerenreiner, pharmazeutischer Wirkstoffvorstufen entwickelt werden. Besonderes Augenmerk wird dabei der Verfahrensoptimierung hinsichtlich einer Minimierung von Abf\u00e4llen und Energiekosten und der Optimierung der Produktausbeuten gelten. Die im Rahmen des Vorhabens zu synthetisierenden Verbindungen stellen Schl\u00fcsselsubstanzen von hoher Gesundheitsrelevanz dar und bergen hinsichtlich ihrer vielf\u00e4ltigen Verwendung als Synthesevorstufen enantiomerenreiner Pharmazeutika ein immenses Marktpotenzial. Zahlreiche in enantiomerenreiner Form ben\u00f6tigte Medikamente, wie z. B. antivirale Wirkstoffe, Atemwegstherapeutika oder Asthmamittel, k\u00f6nnen effizient und umweltschonend aus den Schl\u00fcsselsubstanzen synthetisiert werden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIm Rahmen des Projekts soll das biokatalytische Potenzial gut charakterisierter Enzyme durch Methoden der gerichteten Evolution hinsichtlich verfahrensrelevanter Parameter (K\u00e4lteaktivit\u00e4t, Substratspezifit\u00e4t, Enantioselektivit\u00e4t) optimiert werden. Zus\u00e4tzlich sollen anforderungsgerecht ausgew\u00e4hlte Lipasen oder Esterasen aus neu isolierten Psychrophilen hinsichtlich einer Verfahrenstauglichkeit getestet und gegebenenfalls in den Prozess integriert werden. Begleitend sollen alle notwendigen Aktivit\u00e4ts- und Chiralanalytiken etabliert werden. Eine effiziente Darstellung der Wirkstoffvorstufen erfordert zwingend die Entwicklung eines neuen Synthese- und Produktaufbereitungsverfahrens, welches einerseits eine effektive Darstellung, andererseits eine effiziente, kosteng\u00fcnstige Isolierung der Verbindungen aus dem Reaktionsansatz erm\u00f6glicht. Durch eine optimierte Prozessf\u00fchrung sollen die Produktreinheiten und -ausbeuten signifikant verbessert werden. Das entwickelte Verfahren soll direkt in den Produktionsma\u00dfstab umgesetzt werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die Fr\u00fchphase des Projekts wurde in enger Absprache zwischen den Projektpartnern Rieks GmbH und Universit\u00e4t Greifswald genutzt, um die Modellsubstrate (Acetatester der sekund\u00e4ren Alkohole) in ausreichenden Mengen zu synthetisieren und die notwendige GC- und HPLC-Analytik zu etablieren. Im Rahmen eines umfangreichen Screenings wurden vom Projektpartner Universit\u00e4t Greifswald Esterasebibliotheken insbesondere auf Selektivit\u00e4t f\u00fcr die Modellsubstrate 3-Hydroxytetrahydrofuran und 3-Butin-2-ol getestet. F\u00fcr dieses Screening wurde ein neuer, im Haus etablierter Acetat-Assay erfolgreich im Mikrotiterplatten-Ma\u00dfstab eingesetzt. Es wurden ausgehend von Esterasen (BsteE, BsubE, BsubpNBE, PFEI und SDE) durch error-prone PCR zahlreiche neue Esterasebibliotheken generiert. Insgesamt wurden etwa 1500 neu generierte Klone und 5500 in Esterasebibliotheken des Arbeitskreises bereits vorhandene Varianten auf Aktivit\u00e4ten gegen\u00fcber 2-Acetoxy-3-butin und Tetrahydrofuryl-3-acetat getestet. Ausgehend von den Esterasen PFEI, SDE und BsubpNBE zeigten erfreulicherweise nahezu alle in der error-prone PCR generierten Varianten hohe Aktivit\u00e4t gegen\u00fcber 2-Acetoxy-3-butin. Von den aktiven Klonen konnte eine Variante der PFEI als viel versprechend enantioselektiv ausgew\u00e4hlt, durch Sequenzierung als Dreifachmutante identifiziert und n\u00e4her charakterisiert werden. Durch Quik Change wurden weitere Doppel und Einfachmutanten aus der Dreifachmutante erzeugt. Detaillierte enzymkinetische Untersuchungen f\u00fchrten letztlich zur Auswahl einer f\u00fcr das (S)-2-Acetoxy-3-butin hoch enantioselektiven Doppelmutante. Dieses im Projektverlauf bei der Universit\u00e4t Greifswald erfolgreich hergestellte enantioselektive Enzym wurde dem Projektpartner Rieks GmbH zur Verifizierung \u00fcbergeben. Nach Optimierung der Reaktionsparameter, insbesondere einer Absenkung der Reaktionstemperatur auf 10\u00b0C, erreichte das Enzym einen stabilen 50 %-igen Umsatz mit einem E-Wert von > 90. Im Hinblick auf die gro\u00dftechnische Umsetzung der Resultate erf\u00fcllt diese Enzymmutante somit entscheidende Parameter zur gro\u00dftechnischen Gewinnung von enantiomerenreinen 3-Butin-2-ol. Auf Grund eines fr\u00fchzeitig verf\u00fcgbaren Enzym-Systems, das auch bei tiefen Temperaturen und damit verbundener hoher Selektivit\u00e4t ausreichend aktiv war, konnte indes f\u00fcr das 1-Methoxy-2-propanol die Basis zur Etablierung eines leistungsf\u00e4higen Scale-up beim Projektpartner Rieks GmbH fr\u00fchzeitig geschaffen werden. Der Industriepartner UNA-Synth GmbH konnte bereits nach 6-monatiger Projektlaufzeit wesentliche Arbeiten zum Aufbau einer Anlage zur enantioselektiven Synthese und zur Produktaufbereitung beginnen. Kernst\u00fcck der Entwicklungsarbeiten war dabei die Etablierung einer Extraktionsanlage zur mehrstufigen und selektiven Poduktaufbereitung und gewinnung. Diese Anlage erm\u00f6glichte im Modellsystem die Isolierung und Gewinnung der enantiomerenreinen Produkte aus dem Reaktionsgemisch durch eine Festphasen-Extraktion mittels eines selekti-ven Adsorbens und einer anschlie\u00dfenden stufenweise Eluierung der an die Festphase gebundenen Substanzen mit niedrig siedenden L\u00f6semitteln. Gleichzeitig konnte ein zus\u00e4tzlicher Prozessschritt zur Abtrennung der bei der Racematspaltung anfallenden Essigs\u00e4ure eingespart werden. Aus \u00f6kologischer wie \u00f6konomischer Sicht ist von besonderem Vorteil, dass die gew\u00e4hlte Festphase nach Regeneration wieder verwendet werden kann. Nachdem diese Arbeiten fr\u00fchzeitig erfolgreich abgeschlossen waren, konnte auch das Scale-up aus dem Laborma\u00dfstab heraus fr\u00fcher als geplant eingeleitet werden. Bei diesem Scale-up traten keine wesentlichen unvorhersehbaren Probleme auf, sodass der biotechnologische Herstellungsprozess f\u00fcr (S)-1-Methoxy-2-propanol als erfolgreich etabliert und zug\u00e4nglich angesehen werden kann. Hinsichtlich der Einsparung von L\u00f6sungsmitteln, der Regeneration von Festphasen-Material und der Vermeidung problematischer Phosphatpuffer wurden bei der Prozessetablierung sowohl \u00f6kologische als auch \u00f6konomische Anspr\u00fcche ber\u00fccksichtigt und evaluiert.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
In der zur\u00fcckliegenden Projektphase wurden von den Partnern eine Reihe internationaler Messen zur Pr\u00e4sentation der Zielprodukte genutzt. Hervorzuheben seien hier beispielsweise die Active Ingredients Conference 2003 in Paris oder die CPhI (Chemical and pharmaceutical ingredients) in den Jahren 2002 bis 2004 in Paris, Frankfurt a.M. und Br\u00fcssel. Des Weiteren wurden wissenschaftliche Tagungen wie das DBU-Symposium anl\u00e4sslich der DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen 2003 in M\u00fcnchen, die Biocat 2002 & 2004 in Hamburg, die BioPerspectives 2004 in Wiesbaden, das Tutzing Symposium 2004 (Perspektiven der Biokatalyse) sowie die Tagung Wei\u00dfe Biotechnologie: Erfolgsfaktor f\u00fcr Innovationen und nachhaltiges Wirtschaften in der Chemischen Industrie besucht und Projektergebnisse pr\u00e4sentiert. Neben zahlreichen Posterbeitr\u00e4gen resultieren aus dem Vorhaben 4 hochwertige Zeitschriften-Publikationen.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Im Rahmen des Vorhabens konnte ein Verfahren zur biotechnologischen Synthese enantiomerenreiner sekund\u00e4rer Alkohole erarbeitet werden. Der mittlerweile erreichte technische Stand gen\u00fcgt prinzipiell den Anforderungen an eine Herstellung des enantiomerenreinen sekund\u00e4ren Alkohols (S)-1-Methoxy-2-propanol im Kiloma\u00dfstab. Entsprechende Kampagnen zur Vermarktung des Produkts befinden sich im Status der Akquisition. Apparativ ist das Verfahren flexibel auf vergleichbare Synthesen \u00fcbertragbar. Eine enantiomerenreine Herstellung der Zielsubstanzen 3-Hydroxytetrahydrofuran und 3-Butin-2-ol kann prinzipiell, basierend auf den erarbeiteten Projektergebnissen, erfolgen, sobald entsprechende enantioselektive Enzyme im pr\u00e4parativen Ma\u00dfstab zur Verf\u00fcgung stehen. Zielsetzung im Projekt war insbesondere die Integration enantioselektiver Esterasen in Verfahren zur Synthese enantiomerenreinen 3-Butin-2-ols oder 3-Hydroxytetrahydrofurans. Beim Projektpartner Universit\u00e4t Greifswald wurde im Rahmen einer um-fangreichen Generierung neuer Esterase-Mutanten ein gegen\u00fcber (S)-2-Acetoxy-3-butin hoch enantioselektives Enzym hergestellt und in der finalen Projektphase dem Partner Rieks GmbH \u00fcbergeben. Im Projektanschluss m\u00fcssten nun alle relevanten Reaktionsbedingungen dahingehend optimiert werden, dass eine maximale Enantioselektivit\u00e4t bei gleichzeitig hohem Umsatz an 2-Acetoxy-3-butin einen Herstellungsprozess erm\u00f6glicht. Die erfolgreiche Umsetzung der enzymatischen Racematspaltung von 1-Methoxy-2-propylacetat zur Gewinnung des enantiomerenreinen Alkohols hat die Leistungsf\u00e4higkeit der Strategie einer Reaktionsf\u00fchrung bei tiefen Temperaturen belegt.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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