Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Mykotoxine sind hochgiftige Kontaminationen sekund\u00e4rer Stoffwechselprodukte bestimmter Schimmelpilze in Lebens- und Futtermitteln. Sie stellen eine gro\u00dfe Gef\u00e4hrdung des Verbrauchers dar. Daher kommt ihrem Nachweis eine zentrale Bedeutung im Bereich Lebensmittelsicherheit zu.
\nIm vorliegenden Projekt sollten innovative Agenzien entwickelt werden, welche f\u00fcr die Detektion von Mykotoxinen verwendet werden k\u00f6nnen. Dabei handelt es sich um sog. Plantibodies (in Pflanzen produzierte rekombinante Antik\u00f6rperfragmente).<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIn Rahmen des Projekts sollten rekombinante Antik\u00f6rper (scFvs) gegen f\u00fcnf verschiedene Mykotoxine hergestellt werden: Fumonisin B1 (FB1), Ochratoxin A (OTA), Aflatoxin B1\/M1 (AFL), Nivalenol (NIV) und Deoxynivalenol (DON). So genannte scFvs stellen eine Alternative zu klassischen Antik\u00f6rpern dar. Sie werden in einem System aus Phagen und Bakterien aus scFv-Banken selektiert und anschlie\u00dfend in Bakterien (scFvs) oder auch Pflanzen (Plantibodies) hergestellt.
\nZun\u00e4chst wurde f\u00fcr jedes Mykotoxin mindestens eine Kopplungsstrategie entwickelt, da die Immobilisierung der Haptene f\u00fcr die weiteren Schritte unumg\u00e4nglich war. Dabei wurden verschiedene Immobilisie-rungsmethoden eingesetzt, von denen sich die Biotin-vermittelte Kopplung als die Geeignetste erwies. Anschlie\u00dfend wurde die eigentlich Selektion (Panning) durchgef\u00fchrt. Weitere Schritte waren die molekulare Charakterisierung der erhaltenen Klone auf DNA-Ebene und die Bestimmung deren Expressionsverhaltens. Es wurde auf verschiedene Arten die Bindungseigenschaften der scFvs ermittelt (ELISA, Oberfl\u00e4chenplasmonresonanz). Gegen Ende des Projekts wurde mit der Affinit\u00e4tsreifung einzelner scFvs begonnen, um die zun\u00e4chst niedrige Avidit\u00e4t zu erh\u00f6hen. Parallel zu diesen Arbeiten wurden erste scFv-Gene \u00fcber Agrobakterienvermittelten Gentransfer in Tabakpflanzen eingebracht und Plantibodies produziert.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Zun\u00e4chst musste f\u00fcr jedes Mykotoxin eine geeignete Kopplungschemie entwickelt werden. Es wurden verschiedene Tr\u00e4germaterialien getestet, um herauszufinden, welches am besten geeignet ist. Eingesetzt wurden Magnetic Beads und Biotinvermittelte Immobilisierungen sowie ein Zellulosederivat, welches sich aber als unbrauchbar erwies. Die Beads stellten sich als nachteilig heraus, da sie ein kompli-ziertes Handling erfordern und nicht in den nachfolgenden Biacore-Bindungsanalysen eingesetzt werden konnten. Die besten Ergebnisse lieferte die Kopplung an Biotin-Derivate, welche in vielen F\u00e4llen zur Iso-lation von scFvs f\u00fchrte.
\nAuf Basis dieses Systems wurde gegen alle im Rahmen des Projekts zu bearbeitenden Mykotoxine Panningverfahren durchgef\u00fchrt. F\u00fcr einige Mykotoxine zeigte sich sp\u00e4ter, dass die gew\u00e4hlte Kopplungschemie nicht geeignet war, z. B. f\u00fcr die OTA-Biotin- oder die NIV-Epoxy-Kopplung. Solche Versuchsreihen wurden daher nicht weiter verfolgt. Erfolgreich waren die Panningverfahren gegen FB1-Magnetic Beads, FB1-Biotin, NIV-Biotin und Aflatoxin-BSA. Molekularbiologische Analysen zeigten, dass die erhaltenen scFvs -wie erwartet – recht homogen waren. Die Backbone-Sequenzen enthielten nur wenige Mutationen, die Unterschiede liegen tats\u00e4chlich nur in den CDR3, also den Regionen, die direkt im Kon-takt mit dem Antigen stehen.
\nNach der Subklonierung in bakterielle Expressionsst\u00e4mme wurden verschiedene Aufreinigungsverfahren entwickelt und verwendet: Kovalent gebundene 6x-His Tag Matrizes (Frenzel et al., 2003) sowie Protein A Affinit\u00e4tschromatographie.
\nDie Charakterisierung der Bindungseigenschaften der scFvs wurde in der Regel \u00fcber Oberfl\u00e4chen-Plasmon Resonanz durchgef\u00fchrt, weil hier die Affinit\u00e4t getrennt von der Avidit\u00e4t betrachtet werden konnte. Alternativ kam ein modifizierter ELISA bei einigen scFvs zum Einsatz. Es zeigte sich, dass \u00fcbliche kompetitive ELISA-Systeme, wie sie f\u00fcr klassische Antik\u00f6rper z. B. bei R-Biopharm eingesetzt werden, nicht f\u00fcr scFvs im gegenw\u00e4rtigen Stadium geeignet sind. Die niedrige Avidit\u00e4t (auf die in keinem Schritt des Verfahrens hin selektiert wurde) ist verantwortlich f\u00fcr das schlechte Bindungsverhalten in Standard-ELISAs und erfordert nachfolgende Mutageneseverfahren. Hier wurden verschiedene Verfahren getestet und schlie\u00dflich die SOE PCR (Splicing by Overlap Extension) als die am besten geeignete Methode e-tabliert. Derzeit werden die mutagenesierten scFv-Gene in Phagen eingebracht, um eine Affinit\u00e4tsreifung durchzuf\u00fchren (diese Arbeiten wurden nach Abschluss des Projekts am LGM begonnen). Als ein Proof of Principle wurden nicht affinit\u00e4tsgereifte Antik\u00f6rpergene (als scFv) des Klons scFv-BFB1_02 (Lauer et al., 2005) in Tabakpflanzen eingebracht, die nun diesen scFv als Plantibody exprimieren. Es wurde ge-zeigt, dass der extra f\u00fcr das Projekt konstruierte, bin\u00e4re Vektor f\u00fcr die Herstellung von Plantibodies gut geeignet ist. Als besonders vorteilhaft erwies sich letztendlich der Verzicht auf virale Sequenzen im Vek-tor, denn parallel durchgef\u00fchrte Transformationen mit einem analogen Vektor, der jedoch virale Promo-tersequenzen enthielt (pGI-scFv-General), zeigten, dass die Vitalit\u00e4t der Pflanzen ohne virale Sequen-zen viel h\u00f6her war. Auch diese Arbeiten werden nat\u00fcrlich mit den mutagenisierten scFvs fortgesetzt.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Das Projekt und die erzielten Ergebnisse wurde mehrfach der \u00d6ffentlichkeit vorgestellt: Tagung in Freiburg (2002); Reck et al.: Transkript 10.2003; Frenzel et al.: J. Chromatogr. 2003 (Methode im Rahmen des Projekts entwickelt); Reinard: Bioforum 12.2004; Lauer et al., 2005 J. Agric. Food Chem.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die Produktion rekombinanter Antik\u00f6rpern und Plantibodies gilt als eine Schl\u00fcsseltechnologie f\u00fcr die n\u00e4chsten Jahre, insbesondere wegen des enorm steigenden Bedarfs an Antik\u00f6rpern. W\u00e4hrend bakteriell produzierte scFv gegen Antigene schon von einigen Arbeitsgruppen im Laborma\u00dfstab produziert worden sind (allerdings kaum scFvs, die gegen Haptene gerichtet sind), gibt es noch wenig Erfahrungen mit der gro\u00dftechnischen Produktion von Plantibodies aus Pflanzen. Daher wird die direkte wirtschaftliche Umsetzung noch einige Zeit in Anspruch nehmen. Die prinzipielle Machbarkeit von scFv f\u00fcr Mykotoxine als Haptene konnte im Rahmen des vorliegenden Projekts am Beispiel von Fumonisin B1 gezeigt werden. F\u00fcr einen kommerziellen Einsatz sind weitere Arbeiten zum Beispiel hinsichtlich der Verbesserung der Affinit\u00e4t notwendig (Lauer et al., 2005). Die begonnenen Arbeiten werden auch nach Abschluss der F\u00f6rderphase konzertiert weitergef\u00fchrt.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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