Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ambrariechstoffe besitzen in der Geruchsstoffherstellung eine gro\u00dfe Bedeutung. Gegenw\u00e4rtig wird der Ambrariechstoff Ambroxan in einer dreistufigen Synthese aus dem von Muskateller Salbei (Salvia scla-rea) gebildeten Sclareol gewonnen. Diese Synthese ist jedoch sehr energieaufw\u00e4ndig und erfordert den Einsatz umweltbelastender Chemikalien. Das Marktvolumen von Ambroxan liegt zurzeit mittelwertig bei 20 Tonnen pro Jahr. Hierf\u00fcr ist eine Ausgangsbasis von ca. 33 Tonnen Sclareol pro Jahr notwendig. F\u00fcr die Produktion einer Tonne Ambroxan werden 207 Tonnen verschiedener Einzelstoffe ben\u00f6tigt, die wiederum den Anfall von 206 Tonnen Abfall bedingen. Die anfallenden Substanzen weisen unterschiedliche, insgesamt aber verh\u00e4ltnism\u00e4\u00dfig starke Umwelt- und Gesundheitswirkungen auf. Im Rahmen dieses Projekts sollten die Grundlagen f\u00fcr die umweltschonende Produktion von Ambrariechstoffen erarbeitet werden. Durch den Einsatz biotechnischer Verfahren soll das Entstehen von Umweltgiften vermieden und der Energieaufwand drastisch reduziert werden. Im Gegensatz zum Feldanbau gew\u00e4hrleistet eine in vitro Kultivierung des Muskateller Salbeis eine gleichbleibend hohe Qualit\u00e4t der produzierten pflanzlichen Biomasse ohne den Einsatz von Pflanzenschutzmitteln. Es sollte daher demonstriert werden, dass in vitro Kulturen von Muskateller Salbei geeignet sind, Sclareol f\u00fcr eine mikrobielle Umsetzung zu produzieren. Es war zu \u00fcberpr\u00fcfen, inwieweit sich mit molekularbiologischen Methoden der Wirkstoffgehalt in Muskateller Salbei aber auch in Tabak und Hefen weiter optimieren l\u00e4sst. Es waren Aussagen zur Verfahrens-grundlage zu erarbeiten, L\u00f6sungswege f\u00fcr eine weitere Optimierung und Umsetzung des Verfahrens auf-zuzeigen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenEntsprechend der Zielsetzung gliederte sich das Vorhaben in zwei Teilprojekte. In der BioPlanta GmbH wurde eine Machbarkeitsstudie zur in vitro Kultivierung von Pflanzen, Organen und Zellsuspensionen f\u00fcr die Gewinnung von Sclareol durchgef\u00fchrt. Ausgehend vom Saatgut wurden in vitro Kulturen von Muskateller Salbei angelegt. Anhand von Untersuchungen zur Kultivierung von Muskateller Salbei in Temporary Immersion Systemen bez\u00fcglich Wachstum und Wirkstoffgehalt der geernteten Pflanzen wurden M\u00f6glichkeiten einer wirtschaftlichen Produktion im technischen Ma\u00dfstab abgesch\u00e4tzt. Das Teilprojekt des Instituts f\u00fcr Pflanzenbiochemie beinhaltete eine Machbarkeitsstudie zur gentechnischen Optimierung der Sclareol-Biosynthese. Dazu wurden Ans\u00e4tze zur Isolierung der Sclareol-Biosynthesegene aus Muskateller Salbei verfolgt, um diese in transgenem Muskateller Salbei \u00fcberzuexprimieren oder in andere Organismen, wie z. B. Hefe oder Tabak, zu \u00fcbertragen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die Inkulturnahme von Salvia sclarea durch Sterilaussaat gestaltete sich zun\u00e4chst aufgrund der sehr geringen Keimrate als schwierig. Durch Einsatz von Gibberellins\u00e4ure und Keimung im Dunkeln konnte die Keimrate jedoch deutlich erh\u00f6ht werden (je nach Genotyp auf 30-44 %). Einer dieser beiden Faktoren al-lein war nicht wirksam. Dies zeigt, dass die Keimung unter Standardbedingungen (d. h. Medium ohne Hormonzusatz, Kultur im Licht) durch zwei unabh\u00e4ngige Systeme gehemmt war. Daher wurde aus den vorliegenden Versuchen als Standardprotokoll f\u00fcr die Sterilaussaat von Salvia sclarea die Keimung im Dunkeln auf MS-Medium mit Zusatz von 0,5 mg\/l Gibberellins\u00e4ure abgeleitet.
\nDie Vermehrung der Biomasse konnte erfolgreich auf das Bioreaktorsystem \u00fcbertragen werden. Durch Verwendung unterschiedlicher Modulgr\u00f6\u00dfen konnten Wachstumsraten bis zum Faktor 27 innerhalb von 61 Tagen erreicht werden. Durch die dargestellten Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass eine in vitro Biomasseproduktion von Salvia sclarea im Bioreaktor m\u00f6glich ist.
\nZur Bestimmung des Gehalts an Sclareol in den Dr\u00fcsenhaaren des Muskateller Salbei aus in vitro Kultur wurden zun\u00e4chst verschiedene Analyseverfahren miteinander verglichen. Hierbei zeigte sich die HPLC mit UV\/VIS-Detektion als ungeeignet f\u00fcr die Sclareol-Analytik. Es wurde sowohl eine DC-Methode zum Sclareol-Nachweis erarbeitet, als auch ein Extraktionsverfahren entwickelt, welches eine GC-MS-Analytik m\u00f6glich machte. Letzteres erwies sich als sehr empfindliche und genaue Methode zum Sclareol-Nachweis.
\nMit den etablierten Analyseverfahren konnte Sclareol in den Dr\u00fcsenzellen von Pflanzen aus dem Feldanbau nachgewiesen werden, nicht jedoch in den Bl\u00e4ttern der untersuchten in vitro Pflanzen. Die Konzentration von Sclareol ist in den Dr\u00fcsenhaaren der untersuchten Bl\u00e4tter mit 0,02 % der Frischmasse sehr gering im Vergleich zu den Bl\u00fctenorganen. Jedoch kann dadurch abgeleitet werden, dass die auf den Bl\u00e4ttern befindlichen Dr\u00fcsenhaare grunds\u00e4tzlich f\u00fcr eine Sclareol-Biosynthese geeignet erscheinen. Im Rahmen dieser Arbeiten konnte ferner gezeigt werden, dass die bei Feldpflanzen auf den Bl\u00e4ttern vorkommenden Dr\u00fcsenhaartypen auch bei den in vitro gewachsenen Sprossen vorhanden sind.
\nAus der isolierten poly (A)+ RNA der bl\u00fctenst\u00e4ndigen Dr\u00fcsenhaare wurde eine cDNA Bibliothek erstellt. Es wurden etwa 1000 EST-Klone sequenziert. Die durchschnittliche L\u00e4nge der Klone betrug 410 Basen-paare (bp). In einem Sequenzvergleich mit EST-Sequenzdatenbanken wurden 54 ESTs identifiziert, die eine Homologie zu Genen der Terpen-Biosynthese besitzen. Zw\u00f6lf Klone hatten eine Homologie zu Ge-nen der Diterpensynthase und sieben Klone zum Cytochrom 450s. Ein cDNA-Klon mit einer L\u00e4nge von 300 bp wurde mittels RACE-PCR zu einem vollst\u00e4ndigen cDNA-Klon verl\u00e4ngert, der im Sequenzvergleich eine Homologie zur Copal-Diphosphat-Synthase aus der Tomate Lycoperesicon ssp. besitzt.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Im Rahmen des 10. Internationalen Kongresses f\u00fcr nachwachsende Rohstoffe und Pflanzenbiotechnologie NAROSSA 2004 (7.-8. Juni 2004 in Magdeburg) und des Kongresses Bioperspectives 2004 (4.-6. Mai in Wiesbaden) wurden Pr\u00e4sentationen angemeldet, in denen das Projekt und die erzielten Ergebnisse vorgestellt werden sollen. Die Projektergebnisse sind zur weiteren Ver\u00f6ffentlichung in Fachzeitschriften und bei Kongressen vorgesehen.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die biotechnologische Produktion von Ambrariechstoffen wird unter Anwendung molekularbiologischer Ans\u00e4tze als Erfolg versprechend angesehen. Die Isolierung eines ersten full length clones der Sclareol-Biosynthese-Gene bildet die Voraussetzung f\u00fcr eine gezielte gentechnische Ver\u00e4nderung von Pflanzen zur wirtschaftlichen Produktion von Sclareol. EST-Klone mit Homologien zu den \u00fcbrigen Biosynthese-Genen liegen in der dr\u00fcsenhaarspezifischen cDNA-Bibliothek vor. Durch weiterf\u00fchrende Arbeiten ist eine vollst\u00e4ndige Klonierung der Sclareol-Biosynthese zu erwarten. Eine in vitro Produktion von Sclareol in transgenen Pflanzen erm\u00f6glicht die anschlie\u00dfende mikrobielle Umsetzung zu Ambrariechstoffen. Hierdurch k\u00f6nnte die umweltbelastende chemische Synthese von Ambroxan aus Sclareol nachhaltig durch ein umweltschonenderes biotechnologisches Verfahren ersetzt werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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