Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Mykotoxine stellen auf Grund ihrer toxischen Bewertung und einer gewissen H\u00e4ufung von kontaminierten Lebens- und Futtermittelproben f\u00fcr den Verbraucher ein nicht zu untersch\u00e4tzendes Gef\u00e4hrdungspotenzial dar. Die Gesundheit, Leistungsf\u00e4higkeit und Fertilit\u00e4t von Zuchttieren wird durch Mykotoxine ebenfalls er-heblich beeintr\u00e4chtigt. Ma\u00dfgeblich f\u00fcr die Eind\u00e4mmung der Kontamination in prozessierten Lebensmitteln und in Futtermitteln ist die \u00dcberwachung der Qualit\u00e4t der eingesetzten Rohstoffe. Mit dem Mykotoxin-Antik\u00f6rper-Array sollte ein Test entwickelt werden, der es erm\u00f6glicht in einem einzigen Analysensystem mehrere relevante Mykotoxine gleichzeitig zu erfassen. Der Test sollte sich durch eine einfache Durch-f\u00fchrung und eine kurze Analysezeit auszeichnen und damit eine schnelle Beurteilung der untersuchten Probe erlauben.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZun\u00e4chst wurden die f\u00fcr den Testaufbau notwendigen spezifischen Reagenzien wie Antik\u00f6rper und enzymmarkierte Mykotoxine beim Kooperationspartner hergestellt. Bei R-Biopharm wurden die f\u00fcr Vergleichsmessungen erforderlichen HPLC-Methoden f\u00fcr die Bestimmung der Mykotoxine etabliert. Mit den spezifischen Reagenzien wurden danach die Einzeltests f\u00fcr den Nachweis von Aflatoxin, Ochratoxin A, Deoxynivalenol, T-2 Toxin, Fumonisin und Zearalenon unter Ber\u00fccksichtigung der angestrebten Messbe-reiche entwickelt. Als Plattform f\u00fcr die Testentwicklung diente die 96-well Mikrotiterplatte. Die Detektion wurde mit Hilfe einer photometrischen Messung vorgenommen. Die Komponenten der Einzeltests wur-den zu einem integrierten Multisystem zusammengesetzt, wobei die spezifischen Antik\u00f6rper in einem optimierten Beschichtungsverfahren \u00fcber F\u00e4ngerantik\u00f6rper in den Vertiefungen der Mikrotiterplatte fixiert wurden. Die Mykotoxin-Standardl\u00f6sungen wurden entsprechend der jeweiligen Messbereiche gemischt und auf drei Konzentrationsstufen eingestellt. Ebenso wurden Mischungen der Enzymkonjugate in Verd\u00fcnnungen hergestellt, die in Schachbretttitrationen ermittelt worden waren. Der Test wurde hinsichtlich seiner analytischen Spezifikation und Stabilit\u00e4t der Testkomponenten charakterisiert. Danach wurde die Einsatzm\u00f6glichkeit des Mykotoxin-Antik\u00f6rper-Array f\u00fcr die Analyse von Proben untersucht.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Durch eine optimale Zusammenstellung von monoklonalen Antik\u00f6rpern und Enzymkonjugaten konnte ein empfindlicher Mykotoxin-Antik\u00f6rper-Array-Test f\u00fcr die gleichzeitige Analyse von f\u00fcnf der geplanten Mykotoxine entwickelt werden. Die Gesamtanalysezeit konnte auf ca. 30 Minuten eingestellt werden. Der Test wurde entsprechend der 2 x 10 Minuten Inkubationen Mykotoxin-Antik\u00f6rper-Array 10\/10 benannt.
\nDie 50 %-Dosis-Werte (mittlerer Konzentrationsbereich der Standardkurve) der einzelnen Mykotoxine lag bei ca. 0,3 ppb (Aflatoxin), 22 ppb (DON), 23 ppb (Fumonisin), 1 ppb (T-2 Toxin) und 4 ppb (Zearalenon). Durch die Probenaufarbeitung wurde der Messbereich um Faktor 10 bzw. 50 verschoben. Dadurch wur-den Messungen im relevanten Konzentrationsbereich f\u00fcr die Lebensmittel- und Futtermittel-Kontrolle erm\u00f6glicht.
\nNach Abschluss der Entwicklungsarbeiten wurden 4 Chargen des Array-Testkits in gleicher Weise hergestellt und hinsichtlich Chargenkonformit\u00e4t, Lagerstabilit\u00e4t der Testkit-Komponenten und Reproduzierbarkeit der Testergebnisse charakterisiert.
\nKits der unterschiedlichen Chargen zeigten eine ausgezeichnete \u00dcbereinstimmung hinsichtlich Lage und Form der Mykotoxin-Standardkurven, sodass eine reproduzierbare Herstellung des Arrays mit gleichbleibender analytischer Qualit\u00e4t der Testkits gew\u00e4hrleistet sein sollte. Die Testkomponenten waren bei der empfohlenen Lagerung bei 4 – 8\u00b0C \u00fcber einen Beobachtungszeitraum von mindestens 6 Monaten stabil.
\nDie Untersuchung der Intra- und Interassay Reproduzierbarkeit wurde auf der Basis von dotierten Nullproben durchgef\u00fchrt und ergab f\u00fcr die Reproduzierbarkeit innerhalb eines Testlaufs VK-Werte von 3 bis 10 %. F\u00fcr die Interassay-Reproduzierbarkeit wurden bei Auswertung von f\u00fcnf unabh\u00e4ngigen Tests VK-Werte zwischen 7 und 28 % (Mittelwert 13,9 %) im Bereich der 50 % Dosis Werte gemessen.
\nDie analytische Leistungsf\u00e4higkeit in Bezug auf die Probenanalyse wurde mit 22 unbelasteten Getreide- und Futtermittelproben, sowie 25 Mykotoxinhaltigen Kontrollproben gepr\u00fcft. In der letzten Phase des Projekts wurde der Test erfolgreich zur Charakterisierung von 41 Getreideproben, die aus regul\u00e4ren Kundenanfragen stammten, verwendet.
\nDie mit dem Array erhaltenen Ergebnisse wurden mit Referenzdaten verglichen und f\u00fcr eine qualitative Bewertung anhand von cut off-Werten als negativ (Ergebnis < cut) oder positiv (Ergebnis \u00b3 cut off) eingestuft. Die cut off-Werte wurden auf der Basis der 50 % Dosis der Mykotoxin-Standardkurven f\u00fcr die 1:10 verd\u00fcnnten Proben wie folgt festgelegt: Aflatoxin 3 ppb, DON und Fumonisin 200 ppb, T-2 Toxin 10 ppb und Zearalenon 40 ppb. F\u00fcr die Auswertung der 1:50 verd\u00fcnnten Proben erh\u00f6hten sich diese Werte um Faktor 5.\nDie Testspezifit\u00e4t lag auf der Grundlage dieser cut off-Werte bei der Untersuchung von 22 unbelasteten Proben bei 95,4 %. Von 220 Analysenergebnissen der Nullproben lagen 214 unterhalb der cut off-Werte und wurden somit als negativ (NEG) eingestuft. Die Testsensitivit\u00e4t wurde auf der Basis von Mykotoxin-belasteten Kontrollproben mit 1:10 verd\u00fcnnten Proben mit 100 % ermittelt. Alle mit Mykotoxin kontaminierten Proben wurden in \u00dcbereinstimmung mit dem Vergleichstest POS bestimmt.\nBei der Auswertung der Ergebnisse von insgesamt 88 Getreide- und Futtermittelproben wurde eine zufriedenstellende \u00dcbereinstimmung mit den Einstufungen der Referenztests gefunden. Die gute \u00dcbereinstimmung von Array und Vergleichsdaten spiegelte sich auch in den Korrelationsdiagrammen wider. In einer Gesamtdarstellung aller quantitativ bestimmbaren Wertepaare (n=103) wurde eine Regressionsgerade mit Steigung 0,994 und einem Bestimmtheitsma\u00df von r2 = 0,877 ermittelt.\nEine gewisse Einschr\u00e4nkung der Testqualit\u00e4t stellt die vergleichsweise gro\u00dfe Zahl von nicht mit dem Referenztest \u00fcbereinstimmenden positiven Bewertungen f\u00fcr DON (9\/40) und Zearalenon (14\/33) bei Proben dar, die im Bereich des cut off gemessen wurden.\n\n\n\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation\n\nDas Projekt wurde im Fr\u00fchjahr 2003 auf zwei internationalen Messen (Achema und der Anuga Foodtec) in Form eines Posters und in Form von Flyern vorgestellt. Anl\u00e4sslich der Biotechnica wurde im Oktober 2003 in einer Sonderausgabe von transkript ein Artikel mit dem Titel Innovative Nachweisverfahren f\u00fcr Mykotoxine ver\u00f6ffentlicht, in dem das Projekt gemeinsam mit dem DBU Projekt AZ 13059 (Detektion von Mykotoxinen durch Plantibodies) beschrieben wurde.\n\n\nFazit\n\nMit dem Mykotoxin-Antik\u00f6rper-Array 10\/10 wurde auf der Basis von monoklonalen Antik\u00f6rpern ein immunologisches Nachweissystem etabliert, das in einem Analysengang gleichzeitig f\u00fcnf der wichtigsten Mykotoxine (Aflatoxine, DON, Fumonisine, T-2 Toxin und Zearalenon) in den jeweils relevanten Messbereichen erfasst. Getreide und Futtermittelproben lassen sich nach einer einfachen Probenaufarbeitung mit 1:10 und 1:50 Verd\u00fcnnungen im Test innerhalb von ca. 30 Minuten messen.\nDer Array Test kann sowohl quantitative Ergebnisse anhand der Mykotoxin-Standardkurven als auch qualitative Ergebnisse anhand von cut off-Werten liefern, die noch unter den in EU-Verordnungen festge-legten oder in Richtlinien f\u00fcr Futtermittel empfohlenen H\u00f6chstmengen liegen.\nDie urspr\u00fcnglich geplante Integration von Ochratoxin A in den Array ist aufgrund einer unzureichenden Qualit\u00e4t der zur Verf\u00fcgung stehenden monoklonalen Antik\u00f6rper nicht gelungen. Eine geringe Einschr\u00e4nkung zeigte der Array beim Einsatz in der Probenanalytik hinsichtlich von falsch positiven Befunden im Bereich der cut off-Werte von DON und Zearalenon. Hier w\u00fcrde sich eine Anhebung der cut off-Werte zur Verbesserung der Testspezifit\u00e4t anbieten, da die bisher auf der Basis der 50% Dosis festgelegten cut off-Werte noch deutlich unterhalb der vom Gesetzgeber festgelegten H\u00f6chstmengen liegen.\nDurch den Einsatz einer visuellen Stopp-L\u00f6sung konnte eine Testvariante etabliert werden, mit dem eine semiquantitative Differenzierung im Bereich der cut off-Werte der Mykotoxin-Standardkurven m\u00f6glich war. Damit steht ein einfach zu handhabender Test zur Verf\u00fcgung, mit dem Mykotoxin-Belastungen ohne einen Mikrotiterplatten-Reader visuell detektiert werden k\u00f6nnen.\nDie Chancen f\u00fcr einen kommerziellen Einsatz des Mykotoxin-Antik\u00f6rper-Array Kits werden als sehr gut betrachtet, da f\u00fcr vier der Mykotoxine EU-Verordnungen existieren, die entweder schon in Kraft sind oder in K\u00fcrze g\u00fcltig sein werden. Mit diesen Verordnungen werden H\u00f6chstmengen festgelegt, die von den Messbereichen des Arrays sehr gut abgedeckt werden.\n<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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