Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Aufgrund ihrer \u00f6kologischen Relevanz und ihrer hohen Empfindlichkeit werden einzellige Algen f\u00fcr die Testung von Chemikalien und Umweltproben verwendet (z. B.: ISO 8692 u. DIN 38412 L33). Diese Al-genzellvermehrungshemmtests sind jedoch sehr arbeits- und kostenintensiv. Weiterhin werden gro\u00dfe Mengen an Referenztoxen bzw. kontaminierten Umweltproben ben\u00f6tigt, was umwelthygienisch bedenklich ist. Aus diesen Gr\u00fcnden wird in diesem Projekt das Ziel verfolgt, die Ansatzvolumina zu reduzieren und die Testdurchf\u00fchrung zu automatisieren, wobei gr\u00f6\u00dftm\u00f6gliche \u00dcbereinstimmung mit den DIN-Normen und die Erf\u00fcllung der darin enthaltenen G\u00fcltigkeitskriterien angestrebt werden. Der High-Throughput-Algentest kann dann sowohl zur Bewertung von Umweltproben genutzt als auch als Screeningtest an Automaten zur Synthese neuer Substanzen gekoppelt werden, um das Umweltgef\u00e4hrdungspotenzial neuer Stoffe fr\u00fchzeitig erfassen zu k\u00f6nnen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Polygen GmbH und die H\u00f6lle & H\u00fcttner AG befassen sich mit der Ger\u00e4teentwicklung, w\u00e4hrend die Optimierung des biologischen Testsystems und dessen Adaptation an den Automaten sowie die Validierung des Tests Gegenstand der Arbeiten am Institut f\u00fcr Hygiene und Umweltmedizin sowie bei der Henkel KGaA sind. Die automatisierten Schritte sollen die Pipettierung der Substanzen und Medien, den Transport der Mikrotitrationsplatten in den beleuchteten Inkubator und in definierbaren Zeitabst\u00e4nden den Transport der Platten zum Messger\u00e4t beinhalten. Die Quantifizierung des Algenwachstums erfolgt \u00fcber die Messung der Fluoreszenz. F\u00fcr die Inkubation der Algen wird ein automatisierbarer, temperierbarer, beleuchtbarer Mikrotitrationsplattensch\u00fcttler entwickelt, der eine vollst\u00e4ndige Durchmischung der Testans\u00e4tze bei geringen Verdunstungsraten gew\u00e4hrleistet. Die \u00dcbereinstimmung der Testresultate mit dem herk\u00f6mmlichen Testverfahren soll aufgezeigt werden. Das automatisierte Testverfahren wird schlie\u00dflich anhand von Referenztoxen, Einzelsubstanzen sowie Umweltproben validiert, so dass Schwellen- bzw. Pr\u00fcfwerte abgeleitet werden k\u00f6nnen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Es wurde ein automatisierter High-Throughput-Algentest entwickelt, der konform mit den international und national g\u00fcltigen Normen ist. Damit konnte das Hauptziel des Projekts erreicht werden. Die Ergebnisse lassen sich folgenderma\u00dfen zusammenfassen:
\nDie M\u00f6glichkeit der Automatisierung und Anwendung des miniaturisierten Algenzellvermehrungshemmtests als \u00f6kotoxikologisches Screeninginstrument in einem High-Throughput-Testsystem wurde von der Henkel KGaA evaluiert. Zu diesem Zweck wurde der miniaturisierte Algentest in 24-Well-Mikrotitrationsplatten erfolgreich im Labor etabliert. Die Ergebnisse zeigten zufrieden stellende Korrelationen mit den Testergebnissen des konventionellen Testverfahrens. Die Machbarkeitsstudie best\u00e4tigte die Durchf\u00fchrbarkeit der Automatisation des Tests und der Kopplung mit Robotersystemen der kombinatorischen Chemie. Die Ansatzgr\u00f6\u00dfe des Algenzellvermehrungshemmtest wurde soweit verringert, dass die-ser auf 96-Well-Mikrotitrationsplatten mit einem Testvolumen von 200 \u00b5L durchgef\u00fchrt werden kann. Dabei wurde darauf geachtet, dass die G\u00fcltigkeitskriterien der entsprechenden Normen eingehalten werden. Das Testverfahren wurde schlie\u00dflich anhand von Referenztoxen sowie von Umweltproben validiert. Die Testresultate stimmen im Rahmen der Abweichungen biologischer Systeme mit dem herk\u00f6mmlichen Testverfahren \u00fcberein. Die Limitierung der Bestimmung der Algentoxizit\u00e4t leichtfl\u00fcchtiger Verbindungen konnte aufgezeigt werden, wobei ein Schwellenwert abgeleitet wurde. Sowohl die Untersuchungen bei der Henkel KGaA als auch an der RWTH Aachen ergaben weitestgehend keinen signifikanten Einfluss von Oberfl\u00e4cheneffekten. Forschungsbedarf besteht noch im Bereich der Tenside und hydrophoben, stark toxischen Substanzen. Des Weiteren sollte im Bereich der Oberfl\u00e4cheneffekte zur Erh\u00f6hung der Akzeptanz des miniaturisierten Testverfahrens noch weitere chemisch-analytische Unter-suchungen angestrebt werden.
\nIn Zusammenarbeit der Projektpartner wurde das miniaturisierte Testverfahren erfolgreich auf einen Prototypen des High-Throughput-Algentests \u00fcbertragen. Dazu wurden f\u00fcr den Automatenprototypen sowohl der Mikrotitrationsplattensch\u00fcttler PolyShake als auch die Beleuchtungseinheit entwickelt und hergestellt. W\u00e4hrend der Dauerbelastung wurden mechanische und elektronische Probleme der Sch\u00fcttler diagnostiziert und beseitigt. Daneben wurden f\u00fcr den Prototypen des High-Throughput-Algentests mehrere Einzelkomponenten entwickelt, wie z. B. abnehmbare Deckel f\u00fcr die Mikrotitrationsplatten. Die An-steuerung aller Komponenten wurde in die neu entwickelte Software BioLaneTM Supervisor integriert. Die Zuverl\u00e4ssigkeit des Prototypen wurde im Laboralltag getestet. Technische Probleme ergaben sich zum Ende des Projekts beim Liquid-Handling, so dass in diesem Bereich weiterer Handlungsbedarf besteht. Die Inkubation am Prototypen des High-Throughput-Algentests wurde anhand zahlreicher Chemi-kalien unterschiedlichster physikalisch-chemischer Eigenschaften validiert. Aus diesen Ergebnissen wird ersichtlich, dass der Prototyp des High-Throughput-Algentests konform mit dem konventionellen Testverfahren ist.
\nVon den Hardware-Komponenten eignet sich der Mikrotitrationsplattensch\u00fcttler PolyShake und das Liquid-Handling-System zur weiteren Verwendung au\u00dferhalb den in diesem Projekt gestellten Anforderungen. Zurzeit sind auf dem Markt keine dem PolyShake entsprechenden Ger\u00e4te erh\u00e4ltlich, bei denen neben dem Sch\u00fctteln eine Temperierung m\u00f6glich ist. Das neue Konzept der Pipettierung ist eine preislich gute Alternative zu herk\u00f6mmlichen eigenst\u00e4ndigen Pipettierautomaten, wobei mit dem hier eingesetzten Roboter dieser gleichzeitig auch f\u00fcr andere Handhabungsaufgaben zur Verf\u00fcgung steht. Bereits erfolgreich in anderen Projekten der H\u00f6lle & H\u00fcttner AG eingesetzt wurde die Steuerungs-Software BioLane\u0099 Supervisor. Da die Software vollst\u00e4ndig unabh\u00e4ngig von der Art und der Anzahl der verwendeten Ger\u00e4te ist, kann sie f\u00fcr viele technische Applikationen verwendet werden. Mit BioLane\u0099 Supervisor wurde eine Software entwickelt, die weit \u00fcber die urspr\u00fcnglichen Projektanforderungen hinausgeht.Mit dem High-Throughput-Algentest k\u00f6nnen neben dem routinem\u00e4\u00dfigen Einsatz von Referenztoxen eine gr\u00f6\u00dfere Anzahl von Konzentrationen und Parallelen mitgef\u00fchrt werden. Damit wird die Variabilit\u00e4t und Wiederholbarkeit des Testsystems Algenzellvermehrungshemmtest erh\u00f6ht. Die Einsatzm\u00f6glichkeiten des High-Throughput-Algentests wurden aufgezeigt und beschrieben. Dabei sind insbesondere Untersuchungen interessant, bei denen eine gro\u00dfe Anzahl von Proben auftreten. So kann das Testverfahren zur Aufkl\u00e4rung von Kombinationswirkungen oder bereits in der Entwicklungsphase von neuen Chemikalien eingesetzt werden, wie am Beispiel von Proben aus der Pilotanlage der kombinatorischen Chemie der Henkel KGaA beschrieben wurde.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Die Ergebnisse mit dem nicht-automatisierten 24-Well und 96-Well Algentest wurden auf der 72. Sitzung des DIN Arbeitskreises 5.1
\nBioteste am 03.\/04.05.01 pr\u00e4sentiert. Im Laufe der Diskussion wurde best\u00e4tigt, dass die Mikrotitrationsplattenteste den Anforderungen der beiden DIN-Normen 38412 L9 und L33 entsprechen. Methodisch bedingte Abweichungen bei den Testresultaten sollten jedoch untersucht werden. In Zusammenarbeit mit dem Audiovisuellen Medienzentrum (AVMZ) des Universit\u00e4tsklinikums Aa-chen wurde ein Film \u00fcber den HT-Algentest sowohl in deutscher als auch englischer Sprache produziert. Zurzeit wird ein Faltblatt des Prototypen hergestellt. Daneben wurden die Ergebnisse des Projekts in einer Publikation sowie auf nationalen und internationalen Tagungen mit Vortr\u00e4gen und Postern der \u00d6ffentlichkeit vorgestellt:
\n–\tVortrag auf der 6. Deutschsprachigen SETAC-Tagung \u00d6kotoxikologie und \u00d6kologie in Ballungsr\u00e4umen – global denken – lokal handeln, Berlin, 2001.
\n–\tPoster auf der GDCh-Jahrestagung Chemie, W\u00fcrzburg, 2001.
\n–\tPoster auf dem 12th Annual Meeting SETAC Europe: Challenges in environmental risk assessment and modelling: linking basic and applied research, Wien (\u00d6sterreich), 2002.
\n–\tPoster auf dem 3rd European Meeting on Environmental Chemisty, Genf (Schweiz), 2002.
\n–\tPoster auf dem Bioforum 2003, L\u00fcttich (Belgien), 2003.
\n–\tVortrag auf dem 11th International Symposium on Toxicity Assessment, Wilnius (Lettland), 2003.
\n–\tEisentr\u00e4ger, A., Dott, W., Klein, J. & Hahn, S. (2003): Comparative studies on algal toxicity testing using fluorometric microplate and Erlenmeyer flask growth-inhibition assays. Ecotoxicology and Environmental Safety 54: 346-354.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
In diesem Kooperationsprojekt wurde ein automatisierter High-Throughput-Algentest entwickelt, der konform mit den international und national g\u00fcltigen Normen ist. Damit konnte das Hauptziel des Projekts erreicht werden. Aus den Ergebnissen folgt aber ein weiterer Forschungs- und Entwicklungsbedarf, um die Akzeptanz des miniaturisierten Testverfahrens zu erh\u00f6hen. Es steht ein Messger\u00e4t zur Verf\u00fcgung, das einen wesentlichen Beitrag zum vorsorgenden und nachhaltigen Umweltschutz liefern kann.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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