Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Am Beispiel der Reduktion prochiraler Ketone sollen Ganzzell-Verfahren entwickelt werden, um die Darstellung enantiomerreiner Alkohole bis in den technischen Ma\u00dfstab zu erreichen. Dazu sollen die Eigenschaften der Mikroorganismen zur Durchf\u00fchrung der Hydrierreaktion durch gentechnische Methoden verbessert werden (z. B. durch Coexpression von Reduktase und einem geeigneten Coenzym-regenerierendem Enzym). Als Cosubstrate sollen verschiedene gut metabolisierbare Verbindungen wie Glucose oder Formiat vergleichend gepr\u00fcft werden. Rekombinante Produktionsst\u00e4mme werden im Sch\u00fcttelkolbenma\u00dfstab charakterisiert und der mikrobielle Produktionsprozess im Laborma\u00dfstab opti-miert.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenUnter Verwendung rekombinanter E. coli-Zellen sollen enantioselektive Reduktionen mit ganzen Zellen realisiert werden. Dabei soll neben der gew\u00fcnschten Reduktase ein System zur Coenzym-Regenerierung in E. coli co-exprimiert werden. Nach Entwicklung neuartiger Syntheserouten werden prochirale Ketone f\u00fcr die enantioselektive Reduktion bereitgestellt und die Ganzzell-Umsetzung mit einem biologischen System charakterisiert und kinetisch quantifiziert. Es sollen neuartige Methoden und Apparate entwickelt werden, um eine effiziente Kinetikbestimmung zu erreichen. Die Daten der Kinetikbestimmung k\u00f6nnen als Grundlage f\u00fcr eine anlagen- und prozesstechnische Entwicklung des fermentativen Verfahrens dienen. Unter Verwendung einer dispersen Substratzufuhr soll ein scale-up-f\u00e4higer Fermentationsprozess im Laborma\u00dfstab entwickelt werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im Mittelpunkt der 5 Teilprojekte zur Biohydrierung steht die Reduktion von 3,5-Dioxohexans\u00e4uretert-butylester (bzw. 4-Cl-Acetophenon als Referenzedukt) zu 5-Hydroxy-3-oxo-hexans\u00e4urederivaten mit Hil-fe geeigneter mikrobieller Systeme bis in den technischen Ma\u00dfstab. Im Rahmen der Stammkonstruktion wurde ein Produktionssystem entwickelt, das die Gene der Alkoholdehydrogenase (ADH) aus Lactoba-cillus sp. zusammen mit einer heterolog aus B. subtilis stammenden Glucosedehydrogenase (GDH) plasmid-codiert zur k\u00fcnstlichen NADPH-Regenerierung co-exprimiert. Entsprechende Ganzzellsysteme wurden hinsichtlich der Genanordnung auf dem Plasmid optimiert und vergleichend getestet. Ein Ganzzellsystem wurde in w\u00e4ssrig-organischen L\u00f6sungsmitteln eingesetzt und quantitativ bewertet. Im Teilprojekt Bioorganische Chemie gelang die durch umfangreiche Publikationen belegte regio- und enantioselektive Reduktion von 3,5-Di-ketohexans\u00e4ureestern zu nunmehr allen vier diastereomeren Diolen bis in den 100 g Ma\u00dfstab. Daneben wurden entsprechende Analysetechniken (GC-MS, HPLC und NMR) entwickelt und den Projektpartnern zur Verf\u00fcgung gestellt. Mehrere Methoden zur modellgest\u00fctzten Fed-Batch Versuchsplanung wurden im Teilprojekt Makrokinetik in die MATLAB\/SIMULINK Umgebung implementiert und experimentell validiert. Die sequenzielle \u00dcberpr\u00fcfung der Versuchsplanungstechniken konnte erfolgreich anhand eines L-Valin produzierenden C. glutamicum-Stamms durchgef\u00fchrt werden. Dieser Stamm wurde eingesetzt, da zum Zeitpunkt der experimentellen \u00dcberpr\u00fcfung noch kein geeignetes E. coli-Biotransformationssystem mit Cofaktorregenerierung einsetzbar war. Im Teilprojekt Verfahrenstechnik konnte mit dispersiver Bereitstellung des schlecht wasserl\u00f6slichen 6?Cl-3,5-Dioxohexans\u00e4ure-tert-butylester im R\u00fchrkesselreaktor mit ruhenden Lactobacillus kefir Zellen die Raum-Zeit-Ausbeute um den Faktor 10 auf bis zu 7.5 mmol L-1 h-1 (3R,5S)-Dihydroxyhexanoat bei ei-nem Enantiomeren\u00fcberschuss von \u00fcber 99 % und einer Ausbeute von 55% gesteigert werden. F\u00fcr das Referenzedukt 4-Cl-Acetophenon konnte durch Einsatz von Isopropanol und Glukose als Cosubstrat und intermittierender Edukt-Zudosierung die spezifische Produktbildung bei der asymmetrischen Reduk-tion um den Faktor 2.5 auf 6.3 mmol g-1 L. kefir gesteigert werden. \u00dcber den Einsatz der 3-dimensionalen optischen Laser-R\u00fcckreflexionsmessung (3-D-ORM) zur Bestimmung von Tropfengr\u00f6\u00dfen und -verteilungen in Kombination mit einer offline Bildanalyse konnten mittlere Tropfendurchmesser f\u00fcr beide Edukte bestimmt werden. Die ermittelten Tropfendurchmesser zeigen, dass f\u00fcr die untersuchten Biotransformationen eine ausreichende Stoffaustauschfl\u00e4che zur Verf\u00fcgung gestellt werden kann, so dass keine Stofftransportlimitierung auftritt. Bedingt durch eine strikte Umorientierung zuk\u00fcnftiger Gesch\u00e4ftsbereiche bei dem ehemaligen Kooperationspartner Rhein Biotech GmbH, schied die Firma im Jahr 2002 aus dem laufenden Projekt aus, weshalb im Anschluss die Firma J\u00fclich Fine Chemicals, JFC, deren Rechte und Pflichten f\u00fcr die Projektrestlaufzeit \u00fcbernahm.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
–\tM. Wolberg, A.G. Ji, W. Hummel, M. M\u00fcller, Synthesis, 2001(6): p. 937-942.
\n–\tM. Wolberg, I. A. Kaluzna, M. M\u00fcller, J. Stewart, Bakers yeast reduction of tert-butyl 6-chloro-3,5-dihydroxyhexanoate, Tetrahedron: Asymmetry 2004, 15, (submitted).
\n–\tM. Wolberg, W. Hummel, M. M\u00fcller, Chem. Eur. J., 2001. 7(21): p. 4562-4571.
\n–\tM.A. Brik Ternbach, C. Wandrey, R. Takors (2003) Application of Experimental Designs for Modelling of a Fermentative L-Valine Production Process by Corynebacterium glutamicum, 4th International Symposium on Mathematical Modelling (MATHMOD 4), Wien, 05.-07.02.
\n–\tM.A. Brik Ternbach, C. Wandrey, R. Takors (2003) Model Based Process Development of a Fermentative L-Valine Production Process Using Corynebacterium glutamicum, 21 DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, Garching, 02.-04.04.
\n–\tM. M\u00fcller, R. Takors, W. Hummel, M. Amidjojo, D. Weuster-Botz, C. Wandrey, Poster biocat 2002; 28.7.2002-31.7.2002, Hamburg, 2002.
\n–\tWeckbecker, W. Hummel, M. Amidjojo, D. Weuster-Botz, M. Brik Ternbach, R. Takors, M. M\u00fcller, C. Wandrey, Transkript; Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse, 2003, S. 100-104, 2003<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Durch die gemeinsame Bearbeitung des Projekts von Seiten der Organischen Chemie (Vorstufen-Synthese), der Mikrobiologie\/Genetik (Stammkonstruktion) und der Verfahrenstechnik (Verfahrenstechnische und Makrokinetische Bearbeitung) konnte beispielhaft gezeigt werden, dass es m\u00f6glich ist, mit einem umwelt- und ressourcenschonenden biologischen Verfahren eine stereo- und regioselektive Reduktionsreaktion (Synthese von 3,5-Dihydroxyhexans\u00e4urederivaten) in den technischen Ma\u00dfstab zu \u00fcberf\u00fchren und dabei auf \u00fcblicherweise eingesetzte schwermetallhaltige Katalysatoren zu verzichten.
\nWirtschaftliche Verwertung der Projektergebnisse
\nDie Firma JFC – J\u00fclich Fine Chemicals GmbH hat in der Zwischenzeit die im Institut f\u00fcr Biotechnologie bei Herrn Dr. M. M\u00fcller entwickelte Substratsynthese in den >100 g-Ma\u00dfstab \u00fcbertragen und insgesamt zweimal erfolgreich durchgef\u00fchrt, um einen ersten Auftrag \u00fcber 25 g des tert-Butyl (S)-6-chlor-5-hydroxy-3-oxohexanoat zu erf\u00fcllen. Weitere Produktauftr\u00e4ge in diesem Umfeld werden erwartet.
\nWeitere potenzielle Nutzer oder Kapitalgeber
\nZur Indikation m\u00f6glicher Produkt-Nutzer ist die nachfolgende Publikationsliste zum Thema Verwendung des tert-Butyl (S)-6-chlor-5-hydroxy-3-oxohexanoat (und des entsprechenden (R)-Enantiomers) in der Wirkstoff- und Naturstoffsynthese angegeben:
\n–\tA. Job, M. Wolberg, M. M\u00fcller, D. Enders, Asymmetric Synthesis of S-(+)-Argentilactone and S-(-)-Goniothalamin, Synlett 2001, 1796-1798.
\n–\tJ. L. Vicario, A. Job, M. Wolberg, M. M\u00fcller, D. Enders, Asymmetric Total Synthesis of (-)-Callystatin A Employing the SAMP\/RAMP Hydrazone Alkylation Methodology, Org. Lett. 2002, 4, 1023-1026.
\n–\tD. Enders, J. L. Vicario, A. Job, M. Wolberg, M. M\u00fcller, Asymmetric Total Synthesis of (-)-Callystatin A and (-)-20-epi-Callystatin A Employing the SAMP\/RAMP Hydrazone Alkylation Methodology, Chem. Eur. J. 2002, 8, 4272-4284.
\n–\tD. Enders, A. Lenzen, M. M\u00fcller, Efficient Asymmetric Syntheses of (+)-Strictifolione, Synthesis 2004, 1486-1488
\nWeiterf\u00fchrende Entwicklungsm\u00f6glichkeitenNeben den bereits genannten Themen sind folgende Entwicklungsm\u00f6glichkeiten zu nennen:
\n\u00b7\tDie \u00dcbertragung der Optimierung der LBADH-katalysierten Reduktion des tert-Butyl 6-chlor-3,5-dioxohexanoats kann auch zur des tert-Butyl (R)-6-chlor-5-hydroxy-3-oxohexanoat mit isolierter ADH aus B\u00e4ckerhefe genutzt werden und erlaubt den Zugang zu den vier m\u00f6glichen stereoisomeren 3,5-dihydroxyestern in enantiomerenreiner Form und in pr\u00e4parativen Mengen. Diese k\u00f6nnen wiederum in vielf\u00e4ltiger Form in der Synthese von Polyketid-abgeleiteten Natur- und Wirkstoffen genutzt werden.
\n\u00b7\tDie modelldiskriminierende Versuchsplanungstechnik ist in einer Software Matlab\/Simulink verf\u00fcgbar und steht f\u00fcr entsprechende Anwendungen bereit<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens Am Beispiel der Reduktion prochiraler Ketone sollen Ganzzell-Verfahren entwickelt werden, um die Darstellung enantiomerreiner Alkohole bis in den technischen Ma\u00dfstab zu erreichen. Dazu sollen die Eigenschaften der Mikroorganismen zur Durchf\u00fchrung der Hydrierreaktion durch gentechnische Methoden verbessert werden (z. B. durch Coexpression von Reduktase und einem geeigneten Coenzym-regenerierendem Enzym). Als Cosubstrate […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[47,65,51,52,53],"class_list":["post-21476","projektdatenbank","type-projektdatenbank","status-publish","hentry","tag-klimaschutz","tag-nordrhein-westfalen","tag-ressourcenschonung","tag-umweltforschung","tag-umwelttechnik"],"meta_box":{"dbu_projektdatenbank_az_ges":"13040\/03","dbu_projektdatenbank_medien":"","dbu_projektdatenbank_pdfdatei":"13040-03.pdf","dbu_projektdatenbank_bsumme":"352.062,81","dbu_projektdatenbank_firma":"Forschungszentrum J\u00fclich GmbHInstitut f\u00fcr Biotechnologie 2","dbu_projektdatenbank_strasse":"Postfach","dbu_projektdatenbank_plz_str":"52425","dbu_projektdatenbank_ort_str":"J\u00fclich","dbu_projektdatenbank_p_von":"2000-05-01 00:00:00","dbu_projektdatenbank_p_bis":"2003-12-31 00:00:00","dbu_projektdatenbank_laufzeit":"3 Jahre und 8 Monate","dbu_projektdatenbank_telefon":"02461\/61-3955","dbu_projektdatenbank_inet":"www.fz-juelich.de","dbu_projektdatenbank_bundesland":"Nordrhein-Westfalen","dbu_projektdatenbank_foerderber":"38","dbu_projektdatenbank_ab_bericht":"DBU-Abschlussbericht-AZ-13040_03.pdf","dbu_projektdatenbank_ist_nachbewilligung_von":"","dbu_projektdatenbank_hat_nachbewilligung":"","dbu_headerimage_cover":"","dbu_submenu":"","dbu_submenu_position":"","dbu_submenu_entry":[]},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21476","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/projektdatenbank"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21476\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":34479,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21476\/revisions\/34479"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=21476"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=21476"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=21476"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}