Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Der steigende Bedarf an Brenztraubens\u00e4ure (Pyruvat) im pharmazeutisch-medizinischen Bereich sowie als Nahrungserg\u00e4nzungsmittel erfordert die Etablierung einer Alternative zur energieaufw\u00e4ndigen klassischen Herstellung durch Pyrolyse von Weins\u00e4ure. Ziel des Forschungsprojekts war daher die Entwicklung eines hocheffizienten biotechnologischen Verfahrens zur Herstellung von Pyruvat aus Glucose mittels rekombinanter Escherichia coli-St\u00e4mme. Die dabei eingesetzte Strategie, Zellwachstum und Produktbildung durch die Verf\u00fcgbarkeit eines essenziellen Cosubstrats (Acetat) zu regulieren, besitzt Mo-dellcharakter f\u00fcr viele Fermentationsprozesse.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Stammentwicklung am Institut f\u00fcr Biotechnologie 1 (IBT1) hatte als prim\u00e4res Ziel die Charakterisierung des E. coli-Ausgangsstamms f\u00fcr die Pyruvat-Produktion. Dazu wurden Glucose-Verbrauch und Pyruvat-Bildung von wachsenden und ruhenden Zellen bei unterschiedlichen Glucose- und Acetat-Konzentrationen gemessen, um Bedingungen f\u00fcr eine optimale Pyruvat-Bildung zu finden. Die Ergebnisse deuteten auf Bildung das Nebenprodukts Lactat hin, die durch Deletion des ldhA-Gens eliminiert werden konnte. Der resultierende Produktionsstamm wurde durch Transkriptom-Analysen mit DNA-Microarrays (in Kooperation mit Dr. Volker Wendisch, IBT1) sowie durch Proteom-Analysen mittels 2D-Gelelektrophorese und Identifizierung von relevanten Proteinspots mittels MALDI-TOF-Massen-spektrometrie charakterisiert. Parallel zur Stammentwicklung wurde am Institut f\u00fcr Biotechnologie 2 (IBT2) die Fermentationsentwicklung im Laborreaktor-Ma\u00dfstab (10 l) durchgef\u00fchrt. Dabei wurde einerseits versucht, durch Biomasse-R\u00fcckhaltung mittels Mikro- oder Ultrafiltration hohe Zelldichten und damit hohe Glucose-Umsatz-Raten zu erzielen. Andererseits wurde die Prozessf\u00fchrungsvariante be-stimmt, bei der \u00fcber den gesamten Verlauf von Wachstums- und Produktionsphase die h\u00f6chste Glucose-Pyruvat-Selektivit\u00e4t erreicht wurde. Weiterhin erfolgte eine Optimierung der Prozessregelung, wobei als Parameter die Glucose-Konzentration, die CO2-Bildung, der pH-Wert und die Zelldichte online ver-folgt und ggf. geregelt wurden. Bei der halbtechnischen Realisierung durch die Amino GmbH stand zun\u00e4chst eine Marktrecherche im Vordergrund, gefolgt von der Etablierung einer Aufarbeitungsmethode f\u00fcr Brenztraubens\u00e4ure bzw. Na- und Ca-Pyruvat. Die bei der Fermentationsentwicklung und der halbtechnischen Realisierung erhaltenen Daten wurden dazu verwendet, um Wirtschaftlichkeit, Umweltvertr\u00e4glich-keit und Nachhaltigkeit des Gesamtprozesses zu evaluieren, und zwar im Rahmen des Projekts AZ 13040\/02.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Teilprojekt Stammentwicklung (Prof. Bott): Der E. coli-Stamm YYC202, der aufgrund mehrerer Mutationen Pyruvat nicht mehr zu Acetyl-CoA, Acetat bzw. PEP umsetzen kann, wurde als hervorragender Pyruvat-Produzent charakterisiert, der unter geeigneten Bedingungen Glucose vollst\u00e4ndig in Pyruvat umsetzen kann (>1,9 mol\/mol). Bei h\u00f6heren Glucose-Konzentrationen, insbesondere bei fed-batch-Fermentationen, wurden jedoch erhebliche Mengen (>300 mM) Lactat gebildet. Durch Inaktivierung des ldhA-Gens f\u00fcr die NAD+-abh\u00e4ngige Lactat-Dehydrogenase konnte die Lactat-Bildung vollst\u00e4ndig eliminiert und dadurch deutlich h\u00f6here Pyruvat-Titer, molare Ausbeuten und Raum-Zeit-Ausbeuten erreicht werden. Die Identifizierung des Gens f\u00fcr den Pyruvat-Importer mittels Transposon-Mutagenese und Selektion auf Fluorpyruvat-resistente Klone gelang nicht. Das Multidrug-Efflux-System AcrAB konnte als Pyruvat-Exporter ausgeschlossen werden. Proteomanalysen mittels 2D-Gelelektrophorese und MALDI-TOF-Massenspektrometrie sowie Transkriptom-Analysen mit DNA-Chips zeigten, dass der Glyoxylat-Zyklus in YYC202 vermutlich fehlt und die Pyruvat-Produktion zur Induktion von S\u00e4urestress-Genen f\u00fchrt. Weiterhin zeigte ein Gen f\u00fcr einen bisher nicht charakterisierten sekund\u00e4ren Transporter eine stark erh\u00f6hte Expression, der m\u00f6glicherweise am Pyruvat-Export beteiligt ist.
\nTeilprojekt Fermentationsentwicklung (Dr. Takors): Mit E. coli YYC202ldhA konnte die Laktat-freie Pyruvat-Produktion im Laborma\u00dfstab in einem Glucose- und Acetat-geregelten fed-batch-Ansatz bis zu einem Titer von 700 mM (62 g\/L) mit einer integralen Produkt\/Substrat-Ausbeute von 1,1 mol\/mol erzielt werden. Durch repetitive fed-batch-Prozessf\u00fchrung konnten sogar integrale Ausbeuten von 1,7 mol\/mol und eine Raum-Zeit-Ausbeute von 145 g\/(L*d) erreicht werden. Bei vergleichbarem Produkttiter liegen diese Werte um 10 % bzw. 500 % h\u00f6her als beim Konkurrenz-Verfahren mit Torulopsis glabrata. W\u00e4hrend eine kontinuierliche Prozessf\u00fchrung mit Zellr\u00fcckhaltung keine Verbesserungen ergab, gelang durch einen in-situ product recovery (ISPR)-Ansatz mittels vollst\u00e4ndig integrierter Elektrodialyse die online Abtrennung von Pyruvat aus dem laufenden Prozess bis zu einer Aufkonzentrierung von 550 mM mit einer Raum-Zeit-Ausbeute von 68 g\/(L*d) und einer molaren Ausbeute von 1,19 mol\/mol. Daraus ergibt sich, dass durch Kombination von repetitiver fed-batch-Kultivierung mit integrierter Produktabtrennung durch Elektrodialyse ein sehr effizientes Verfahren zur mikrobiellen Pyruvat-Produktion mit dem E. coli-Stamm YYC202 ldhA zur Verf\u00fcgung steht. Dar\u00fcber hinaus konnten einfache, nicht-strukturierte, formal-kinetische Modelle zur Beschreibung von Wachstum, Substratverbrauch und Produktbildung identifiziert werden, die die Basis f\u00fcr simulative Scale-up Studien und Prozessoptimierungen bieten.
\nTeilprojekt halbtechnische Realisierung (Prof. Faurie): Das Biotransformations-Verfahren des IBT wurde im Hinblick auf die Verwendung der Brenztraubens\u00e4ure bzw. der Na\/Ca-Pyruvate als Pharma-Food-Wirkstoff analytisch bewertet. Neben pharmagerechten Analyseverfahren wurden Spezifikationen erarbeitet und erfolgreich an Modell\u00f6sungen ein entsprechendes umweltfreundliches Downstream-Processing-Verfahren f\u00fcr die Herstellung von Brenztraubens\u00e4ure bzw. Na\/Ca-Pyruvaten entwickelt. Das Verfahren erlaubt die Herstellung von Pharma-Food-Qualit\u00e4ten mit minimaler Nebenproduktbildung und ist deshalb ein gutes Beispiel f\u00fcr produktionsintegrierten Umweltschutz. Eine detaillierte Marktanalyse konnte die Chancen und Risiken bei der Vermarktung von Brenztraubens\u00e4ure bzw. Na\/Ca-Pyruvaten aufzeigen. Dabei zeigte sich, dass die Verwendung von Pyruvat als Rohstoff sehr interessant ist und deshalb weiter verfolgt wird.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
–\tGerharz, T., Zelic, B., Takors, R. und Bott, M. (2001): Produktion von Pyruvat aus Glucose mit Escherichia coli. In Biokatalyse, Spektrum Akademischer Verlag (Heidelberg), pp. 29-33.
\n–\tGerharz, T., Morjan, K., Polen, T., Wendisch, V.F. and Bott, M. (2003): Highly efficient production of pyruvate or L-alanine from glucose using acetate-auxotrophic Escherichia coli strains. In Vorbereitung.
\n–\tGerharz, T. (2003): Pyruvat-Produktion durch acetat-auxotrophe Escherichia coli-St\u00e4mme. Dissertation, Universit\u00e4t D\u00fcsseldorf.
\n–\tTakors, R., Zelic, B., Gerharz, T. und Bott, M. (2003): Pyruvat-Produktion aus Glucose mit rekombinanten Escherichia coli-St\u00e4mmen. Transkript, Sonderband Nachhaltige Biokatalyse, 96-99.
\n–\tZelic, B. (2003): Study of the process development for Escherichia coli based pyruvate production. Dissertation, University of Zagreb.
\n–\tZelic, B., Gerharz, T., Bott, M., Vasic-Racki, D., Wandrey, C. and Takors, R. (2003): Fed-batch process for pyruvate production by recombinant Escherichia coli YYC202 strain. Eng. Life Sci. 3: 299-305.
\n–\tZelic, B., Gostovic, S., Vuoriletho, K., Vasic-Racki, D., und Takors, R. (2004): Process strategies to enhance pyruvate production with recombinant Escherichia coli: From repetitive fed-batch to ISPR with fully integrated electrodialysis. Biotechnol. Bioeng. 85: 638-646.
\n–\tZelic, B., Vasic-Racki, D., Wandrey, C. and Takors, R. (2004): Modeling of the pyruvate production with Escherichia coli in a fed-batch bioreactor. Bioproc. Biosyst. Eng., 26: 249-258.
\n–\tBott, M. (2001): Pathway analysis and metabolic engineering of bacteria for the production of useful compounds. Vortrag im Rahmen der Biotechnika am 11. Oktober in Hannover.
\n–\tGerharz, T. und Bott, M. (2001): Pyruvate production from glucose by a recombinant Escherichia coli strain. Posterpr\u00e4sentation bei der Tagung Biotrans 2001 vom 2.-9. September in Darmstadt.
\n–\tGerharz, T. (2001): Pyruvate production from glucose by a recombinant Escherichia coli strain. Vortrag im Rahmen eines Workshops des Graduierten-Kollegs Molekulare Physiologie der Universit\u00e4t D\u00fcsseldorf vom 23.-25. November in Bad Neuenahr-Ahrweiler.
\n–\tGerharz, T. und Bott, M. (2002): Pyruvate production from glucose by a recombinant Escherichia coli strain. Vortrag bei der Jahrestagung der VAAM vom 24.-27. M\u00e4rz in G\u00f6ttingen.
\n–\tGerharz, T., Zelic, B., Takors, R. und Bott, M. (2002): Pyruvate production from glucose by acetate-auxotrophic Escherichia coli strains. Posterpr\u00e4sentation bei der Biocat-Tagung vom 28.-31. Juli in Hamburg.
\n–\tGerharz, T. und Bott, M. (2002): Pyruvate production from glucose by a recombinant Escherichia coli strain. Posterpr\u00e4sentation im Rahmen der Tagung Metabolic Engineering IV: Applied system biology vom 6.-11. Oktober in Castelvecchio Pascoli, Italien.
\n–\tZelic, B., Takors, R., Vasic-Racki, D. und Wandrey, C. (2001): Process development for Escherichia coli-based pyruvate production. Posterpr\u00e4sentation im Rahmen des Croatian symposium of chemical engineers vom 10.-13. Juni, Osijek, Kroatien.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die im Projektantrag formulierten Ziele konnten klar erreicht und in vielen F\u00e4llen sogar \u00fcbertroffen werden. Es konnte ein rekombinanter Escherichia coli-Stamm konstruiert und charakterisiert werden, der mit bisher unerreichten Raum-Zeit-Ausbeuten und Selektivit\u00e4t Glucose in Pyruvat umsetzt und ausscheidet. Die Evaluierung des Prozesses hinsichtlich Wirtschaftlichkeit, Umweltvertr\u00e4glichkeit und Nachhaltigkeit ergab klare Vorteile f\u00fcr das biotechnologische Verfahren gegen\u00fcber dem chemischen Verfahren zur Pyruvat-Herstellung durch Brenzen von Traubens\u00e4ure. Insofern kann ein sehr positives Fazit gezogen werden und das beschriebene Verfahren als Musterbeispiel f\u00fcr die Vorz\u00fcge biotechnologischer Produktionsprozesse mit rekombinanten Mikroorganismen aufgef\u00fchrt werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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