Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) ist ein potenzielles Ausgangssubstrat f\u00fcr die enzymatische Synthese von Kohlenhydratbausteinen, Phospholipiden und Nukleosiden. Im Rahmen des geplanten Forschungsprojekts soll L-G3P im Sinne des produkt- bzw. produktionsintegrierten Umweltschutzes mit Hilfe der B\u00e4ckerhefe S. cerevisiae als Biokatalysator gewonnen werden. Dabei werden nachwachsende Rohstoffe eingesetzt und das Produkt ist von hoher Qualit\u00e4t, da stereochemisch rein. Kohlenhydrate spielen eine Schl\u00fcsselrolle bei der Interaktion von Zellen. Dies wird durch die zunehmende Aufkl\u00e4rung medizinisch relevanter biologischer Prozesse (z. B. Immunantwort, Entz\u00fcndungsprozesse, Metastasenbildung) belegt. F\u00fcr die Herstellung von Pharmaka zur Beeinflussung solcher Prozesse (z. B. Enzyminhibitoren) werden daher sowohl nat\u00fcrliche Kohlenhydrate als auch deren Analoga ben\u00f6tigt. Derartige Kohlenhydra-te m\u00fcssen in aufw\u00e4ndigen chemischen Synthesen hergestellt werden, zumal die gezielte Wirkung von Pharmaka eine hohe stereochemische Reinheit der Produkte erfordert. In der chemischen Synthese dieser Substanzen werden aggressive Phosphorylierungsagenzien eingesetzt. Alternativ besteht die M\u00f6glichkeit, solche Kohlenhydrate \u00fcber die Zwischenstufe des Dihydroxyacetonphosphats (DHAP) mit Hilfe von Aldolasen aus L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) enzymatisch herzustellen. Die geplante nachhaltige Produktion von L-G3P, die zudem preiswert ist, macht die enzymatische Zuckersynthese \u00f6konomisch realisierbar und verk\u00f6rpert daher auch f\u00fcr die Kohlenhydratsynthese eine Ma\u00dfnahme des produkt- bzw. produktionsintegrierten Umweltschutzes.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenL-G3P ist kein Endprodukt, sondern ein Intermediat des Hefestoffwechsels. Grunds\u00e4tzlich gibt es zwei M\u00f6glichkeiten die Konzentration eines solchen Metaboliten zu erh\u00f6hen: i) die Beschleunigung seiner Produktion und ii) die Reduktion bzw. Verhinderung seiner Verstoffwechselung. Schlie\u00dflich kann man beide Wege miteinander kombinieren. Um die Biosynthese von L-G3P zu forcieren, wurde die Aktivit\u00e4t der Glycerol-3-Phosphat-Dehydrogenase erh\u00f6ht bzw. die Aktivit\u00e4t der Pyruvatdecarboxylase, des Schl\u00fcsselenzyms der alkoholischen G\u00e4rung, reduziert. Die Weiterverstoffwechselung des Zielmetaboliten wurde unterbunden, indem die beiden Gene GPP1 und GPP2 ausgeschaltet wurden, welche f\u00fcr die beiden Isoenzyme der Glycerol-3-Phosphatase in der Hefe kodieren. Nach Auswahl des am besten ge-eigneten Produktionstamms im Hinblick auf Wachstumsverhalten und L-G3P-Produktion wurde die Pro-duktion von L-G3P in diesem Stamm detaillierter untersucht und durch Anpassung der Fermentations-bedingungen optimiert. Es folgten Stabilit\u00e4tsuntersuchungen von L-G3P im Hinblick auf enzymatische Degradation. Au\u00dferdem wurde eine umweltfreundliche Extraktionsmethode gefunden. Dar\u00fcber hinaus wurden erste Schritte im Hinblick auf eine selektive und kontinuierliche Ausschleusung des Zielmetaboliten unternommen.
\nF\u00fcr die Konstruktion der verwendeten Vektoren wurden die g\u00e4ngigen molekularbiologischen Methoden (Isolation von Plasmid-DNA aus E. coli, Transformation von E. coli, Agarosegelelektrophorese, PCR, Restriktion und Ligation von DNA) verwendet. Die Hefezellen wurden mit Hilfe der Elektroporations-methode transformiert. Um die Transformanden zu \u00fcberpr\u00fcfen, wurde eine Isolation von Gesamt-DNA aus den Hefen durchgef\u00fchrt, diese anschlie\u00dfend in E. coli r\u00fccktransformiert (bei Nutzung von Plasmidvektoren) oder mittels PCR bzw. Southern-Blot (bei Ver\u00e4nderungen in der genomischen DNA der Hefe) analysiert. F\u00fcr die Bestimmung der intrazellul\u00e4ren Konzentration von L-G3P wurden Batch-Fermentationen im Minimalmedium durchgef\u00fchrt, welches 2 % Glukose und die erforderlichen Aminos\u00e4uren enth\u00e4lt. Die Messung der intrazellul\u00e4ren Konzentration von L-G3P erfolgte nach Extraktion aus den Zellen mit Hilfe einer enzymatischen Bestimmungsmethode (optischer Test). Die Lipidkonzentratio-nen wurden in Kooperation mit der Universit\u00e4t Graz mittels D\u00fcnnschichtchromatographie bestimmt.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Um eine Akkumulation des Stoffwechselzwischenprodukts L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) zu erreichen, wurde der Stoffwechsel der Hefe entsprechend angepasst. Durch Ver\u00e4nderungen von Enzymaktivit\u00e4ten gelang es, zum einen den Metabolitfluss in Richtung L-G3P auf Kosten der alkoholischen G\u00e4rung zu verst\u00e4rken (Multicopy-Expression des GPD1-Gens, Deletion des PDC2-Gens) und zum anderen den Metabolitfluss von L-G3P zu Glycerol vollst\u00e4ndig zu unterbinden (Deletion der Gene GPP1 und GPP2). Die h\u00f6chste Akkumulation von L-G3P wurde in dem Stamm Dgpp1\/Dgpp2\/Dpdc2+GPD1 erreicht. Aller-dings f\u00fchrte die Deletion von PDC2 zu einer starken Beeintr\u00e4chtigung des Wachstums. Einen guten Kompromiss stellt der Stamm Dgpp1\/Dgpp2+GPD1 dar. Dieser Stamm produziert zwar etwas weniger L-G3P als der Stamm Dgpp1\/Dgpp2\/Dpdc2+GPD1, w\u00e4chst aber erheblich besser und wurde deshalb f\u00fcr die weiteren Experimente innerhalb des dritten Jahres der Projektlaufzeit zur detaillierten Untersuchung und Optimierung der L-G3P-Produktion verwendet. Als wichtige Einflussgr\u00f6\u00dfe stellte sich die Verf\u00fcgbarkeit von Luftsauerstoff heraus. Es konnte gezeigt werden, dass die Anwesenheit von Sauerstoff nicht nur die Bildung von L-G3P verhindert und das Wachstum des rekombinanten Hefestamms f\u00f6rdert, sondern auch zu einem schnellen Abbau von bereits akkumuliertem L-G3P in Zellen f\u00fchrt, die zuvor anaerob kul-tiviert wurden. Die maximale gemessene intrazellul\u00e4re Konzentration an L-G3P in dem Stamm Dgpp1\/Dgpp2+GPD1 betrug bei sauerstofflimitierter Kultivierung etwa 25 mg\/g Hefetrockenmasse. Dies entspricht etwa dem 150-fachen der Ausgangssituation im Wildtypstamm. F\u00fcr das Downstream Processing ist es von Vorteil, wenn die Zielsubstanz nicht aus den Zellen, sondern aus dem Medium aufgereinigt werden kann. Interessanterweise konnte im Kultur\u00fcberstand eine L-G3P-Konzentration von etwa 20 mg\/l nachgewiesen werden, obwohl die Substanz nicht membrang\u00e4ngig ist. Dies betr\u00e4gt etwas mehr als 50% der Gesamtmenge an gebildetem L-G3P (Summe aus intra- und extrazellul\u00e4rem L-G3P: 41 mg\/l). Es ist bisher noch nicht gekl\u00e4rt, ob das L-G3P im zellfreien \u00dcberstand ausschlie\u00dflich aus lysierten Zellen stammt. In jedem Fall l\u00e4sst sich intrazellul\u00e4res L-G3P durch Kochen der Zellen in den zellfreien \u00dcber-stand extrahieren und kann auf diese Weise gewonnen werden. Die Tatsache, dass der erste Meilenstein des Projekts, d. h. die Konstruktion von genetisch ver\u00e4nderten Hefest\u00e4mmen zur Produktion von L-G3P, etwas sp\u00e4ter erreicht wurde als geplant, lag vor allem an den unerwarteten Schwierigkeiten, die bei der Einf\u00fchrung der PDC2-Deletion aufgetreten sind. Das zweite Arbeitspaket wurde im Zuge der erhaltenen Forschungsergebnisse obsolet, da eine Trennung von Biomasse- und Produktbildung auch oh-ne molekulargenetische Eingriffe m\u00f6glich ist. Da es erstrebenswert ist, L-G3P aus dem Kultur\u00fcberstand zu isolieren, wurde damit begonnen, die Zellen so zu ver\u00e4ndern, dass sie die Zielsubstanz kontinuierlich in das Medium ausschleusen. Den Wirtschaftlichkeitsbetrachtungen wurde zu Grunde gelegt, dass ca. 25 g Hefetrockenmasse pro Liter erhalten werden k\u00f6nnen. Die angenommenen Kosten von 15.000 \u0080 f\u00fcr eine Fermentation im 3000 l-Ma\u00dfstab inklusive anschlie\u00dfender Aufreinigung des L-G3P entstammen Kalkulationen der Firma Bitop AG, Witten. Es ergeben sich Herstellungskosten von ca. 4,90 \u0080\/g L-G3P. Zum Vergleich wurde der Katalogpreis von Sigma-Aldrich herangezogen (137,7 \u0080\/g). Selbst wenn nur 10% des Verkaufspreises den Herstellungskosten entsprechen, liegen die kalkulierten Produktionskosten mit dem neuen Verfahren nur bei etwa 50%. Sollte es zus\u00e4tzlich gelingen, das Produkt kontinuierlich in das Medium auszuscheiden, k\u00f6nnen die Produktionskosten noch erheblich sinken.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Nevoigt, E., Nguyen, H.T.T., Stahl, U. (2001): Biotechnologische Produktion von L-Glycerol-3-Phosphat. Biokatalyse. Sonderausgabe der DBU in Kooperation mit Biospektrum, 33-35.
\nNguyen, H.T.T., Nevoigt, E., Athenstaedt, K., Truong, H.N., Stahl, U. (2002): Biotechnological Production of L-glycerol 3-phosphate. Biocatalysis, Hamburg, Germany, Posterpr\u00e4sentation.
\nNguyen, H.T.T., Athenstaedt, K., Truong, H.N., Stahl, U., Nevoigt, E. (2002): Engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of L-glycerol 3-phosphate. Metabolic engineering IV, Castelvecchio Pascoli, Italien, Posterpr\u00e4sentation.
\nNguyen, H.T.T., Athenstaedt, K., Truong, H.N., Stahl, U., Nevoigt, E. (2003): Engineering of Saccharomyces cerevisiae for production of L-glycerol 3-phosphate. XXI International Conference on Yeast Genetics and Molecular Biology, G\u00f6teborg, Schweden, Posterpr\u00e4sentation.
\nNguyen, H.T.T., Dieterich, A., Stahl, U., Nevoigt, E. (2003): Genetische Optimierung der B\u00e4ckerhefe zur Produktion von L-Glycerol-3-Phosphat. Transkript Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse, 47-49.
\nNguyen, H.T.T., Dieterich, A., Athenstaedt, K., Truong, N.H., Stahl, U. und Nevoigt, E. (2003): Engineering of Saccharomyces cerevisiae for the production of L-glycerol 3-phosphate. Eingereicht zur Ver\u00f6ffent-lichung in Metabolic Engineering.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die aus B\u00e4ckerhefe isolierbare Menge an L-G3P konnte innerhalb der bisherigen Projektlaufzeit durch das durchgef\u00fchrte Metabolic engineering und die Optimierung der Kultivierungs- und Extraktionsbedin-gungen auf ca. 41 mg\/l (Summe aus intra- und extrazellul\u00e4rem L-G3P) gesteigert werden. Dies entspricht einer mehr als 250-fachen Akkumulation im Vergleich zur Ausgangssituation im Wildtypstamm. Das Fermentationsprodukt steht damit potenziell als Baustein f\u00fcr die umweltfreundliche und \u00f6konomische enzymatische Synthese von Kohlenhydraten zur Verf\u00fcgung. Fermentation und Extraktion selbst folgen der Ma\u00dfgabe des produktionsintegrierten Umweltschutzes: Nachwachsende Rohstoffe k\u00f6nnen eingesetzt werden, der Energieverbrauch ist gering, umweltgiftige oder gesundheitsgef\u00e4hrdende Stoffe kommen nicht zum Einsatz. Als enantiomerenreines Hochwertprodukt mit Produktionskosten von derzeit gesch\u00e4tzten 5 \u0080\/g kann sich fermentativ hergestelltes L-G3P im Vergleich mit dem Gro\u00dfanbieter wahr-scheinlich am Markt behaupten (Produktionskosten der Konkurrenz beruhen auf Sch\u00e4tzung). Der wichtigste n\u00e4chste Entwicklungsschritt im Hinblick auf eine verbesserte Konkurrenzf\u00e4higkeit betrifft die selektive und kontinuierliche Ausschleusung der Zielsubstanz aus dem Produktionsorganismus.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens L-Glycerol-3-Phosphat (L-G3P) ist ein potenzielles Ausgangssubstrat f\u00fcr die enzymatische Synthese von Kohlenhydratbausteinen, Phospholipiden und Nukleosiden. Im Rahmen des geplanten Forschungsprojekts soll L-G3P im Sinne des produkt- bzw. produktionsintegrierten Umweltschutzes mit Hilfe der B\u00e4ckerhefe S. cerevisiae als Biokatalysator gewonnen werden. Dabei werden nachwachsende Rohstoffe eingesetzt und das Produkt ist von hoher […]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[58,47,52,53],"class_list":["post-21474","projektdatenbank","type-projektdatenbank","status-publish","hentry","tag-berlin","tag-klimaschutz","tag-umweltforschung","tag-umwelttechnik"],"meta_box":{"dbu_projektdatenbank_az_ges":"13040\/06","dbu_projektdatenbank_medien":"Innovationen f\u00fcr die Umwelt - Biotechnologische Produktion von Pharmakabausteinen","dbu_projektdatenbank_pdfdatei":"13040-06.pdf","dbu_projektdatenbank_bsumme":"261.285,49","dbu_projektdatenbank_firma":"Technische Universit\u00e4t BerlinFakult\u00e4t III - ProzesswissenschaftenInstitut f\u00fcr BiotechnologieFachgebiet Mikrobiologie und Genetik (GG5)","dbu_projektdatenbank_strasse":"Seestr. 13","dbu_projektdatenbank_plz_str":"13353","dbu_projektdatenbank_ort_str":"Berlin","dbu_projektdatenbank_p_von":"2000-05-01 00:00:00","dbu_projektdatenbank_p_bis":"2003-12-31 00:00:00","dbu_projektdatenbank_laufzeit":"3 Jahre und 8 Monate","dbu_projektdatenbank_telefon":"030\/314-72750","dbu_projektdatenbank_inet":"","dbu_projektdatenbank_bundesland":"Berlin","dbu_projektdatenbank_foerderber":"36","dbu_projektdatenbank_ab_bericht":"","dbu_projektdatenbank_ist_nachbewilligung_von":"","dbu_projektdatenbank_hat_nachbewilligung":"","dbu_headerimage_cover":"","dbu_submenu":"","dbu_submenu_position":"","dbu_submenu_entry":[]},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21474","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/projektdatenbank"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"version-history":[{"count":2,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21474\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":42851,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21474\/revisions\/42851"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=21474"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=21474"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=21474"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}