Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
In einem innovativen Verfahren soll durch extremophile Mikroorganismen ein hochwertiger aminos\u00e4uren- und peptidreicher Futtermittelzusatz gewonnen werden. Dabei wird die Entsorgung eines Abfallstoffs mit der Gewinnung eines vermarktbaren Produkts kombiniert und auf \u00f6kologisch und \u00f6konomisch vorteilhafte Weise ein Beitrag zum produktionsintegrierten Umweltschutz geleistet sowie der Vorgabe des Kreislaufwirtschafts- und Abfallgesetzes zur vorrangigen Abfallweiterverwertung gegen\u00fcber der Beseitigung entsprochen. Das Ziel des vorliegenden Forschungsantrags ist die biotechnologische Gewinnung einer komplexen Mischung von Proteinhydrolysaten aus Abfallfedern, die bei Gefl\u00fcgelschlachtereien in gro\u00dfen Mengen anfallen. Die Federn galten bislang als biologisch schwer abbaubar und werden heutzutage gr\u00f6\u00dftenteils chemisch-physikalisch zu Federmehl verarbeitet. Das neu zu entwickelnde Verfahren soll eine wirtschaftlich rentable Gewinnung eines proteinreichen Futtermitteladditivs erm\u00f6glichen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenF\u00fcr den biologischen Abbau soll der an der TUHH bereits isolierte hyperthermophile Mikroorganismus Fervidobacterium pennivorans oder seine aufgereinigten Enzyme eingesetzt werden. Um den Abbau der Federn zu einem vermarktbaren proteinreichen Futtermitteladditiv in ein wirtschaftlich rentables Verfahren zu integrieren, soll die Raum-Zeit-Ausbeute durch die Anwendung eines Membranverfahrens deutlich gesteigert werden. Nach Optimierung der Betriebsbedingungen im Laborma\u00dfstab und Auswahl ge-eigneter Membranmodule soll in Kooperation mit dem in der anaeroben Abfallverwertung erfahrenen und \u00fcber die logistischen Voraussetzungen verf\u00fcgenden Verwertungsunternehmen Biokraftwerke F\u00fcrstenwalde GmbH und Gefl\u00fcgelschlachtereien eine Anlage im Technikumsma\u00dfstab realisiert werden. Durch eine Wirtschaftlichkeitsanalyse und umfangreiche Recherche sollen au\u00dferdem die Marktf\u00e4higkeit des Verfahrens und die entscheidenden Scale-up-Kriterien bestimmt werden, um sp\u00e4ter eine schnelle Markteinf\u00fchrung zu gew\u00e4hrleisten.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Um die Umsetzung von Keratinen zu Aminos\u00e4uren und Peptiden effektiv durchf\u00fchren zu k\u00f6nnen, ist es erforderlich rekombinante thermostabile Proteasen in gro\u00dfen Mengen zu produzieren. Obwohl die Keratinase aus Fervidobacterium pennivorans in E. coli kloniert werden konnte, konnte kein aktives Enzym exprimiert werden (Kooperation: Prof. W. de Vos, Kluskens et al., 2002). Als Alternative zur Keratinase aus F. pennivorans wurde ein neuer Stamm Thermoanaerobacter keratinophilus auf die F\u00e4higkeit Kera-tin abzubauen untersucht. Es wurde ein in vivo Abbau von Keratin durch eine extrazellu\u00e4re Serin-Protease nachgewiesen. Die Protease arbeitet in einem breiten Temperatur- und pH-Spektrum mit einer optimalen Aktivit\u00e4t bei 85\u00b0C und pH 8,0. Durch den Einsatz von degenerierten Primern, die Teilsequenzen der katalytischen Triade einer Serinprotease flankieren, konnte die Protease kodierende Sequenz aus T. keratinophilus detektiert werden. Diese Sequenz konnte in den Expressionsvektor pQE30 ligiert werden und es wurde der Nachweis erbracht, dass die Protease aktiv exprimiert wird. Damit ist der Weg frei f\u00fcr die geplante in vitro Untersuchung. Ein weiterer Ansatz war die Klonierung der Protease kodierenden Sequenz in B. megaterium. Das Proteasegen konnte in dem von Prof. Dr. Jahn am Institut f\u00fcr Mikrobiologie der TU Braunschweig zur Verf\u00fcgung gestellten Vektor pMM1520 kloniert werden. Die Transformation in Bacillus megaterium ist gelungen, so dass das heterologe Gen aktiv exprimiert wird, jedoch findet zz. noch keine Sekretion statt.
\nDa der in vivo Abbau hinsichtlich eines technischen Verfahrens zu niedrig ist, wurde die Variante eines Zwei-Stufen-Prozesses gew\u00e4hlt, bei der erst das Enzym mit dem Wildstamm Thermoanaerobacter keratinophilus produziert und im zweiten Schritt mit Hilfe dessen Protease der Abbauprozess durchgef\u00fchrt wird, da erst jetzt ein Produktionsstamm vorliegt. Erfolg versprechende Kultivierungsergebnisse im Vial wurden vergleichend im Fermenter untersucht, allerdings zeigte sich hier eine deutlich reduzierte Enzymproduktivit\u00e4t als im Vial (Vial: 600-900 U\/l, Fermenter:130 – 150 U\/l). F\u00fcr den Wildstamm ergibt sich das anfangs eingesetzte Medium mit Begasung von Stickstoff nur w\u00e4hrend der Lag-Phase. In diesem Fall wurden etwa 130 U\/l erreicht, allerdings waren die Fermentationen nicht Scale-up f\u00e4hig. Mit dem rekombinanten E. coli hingegen wurde ein Fedbatch-Verfahren entwickelt, welches 4000 U\/l Enzymaktivit\u00e4t lieferte. Das Verfahren mit exponenzieller F\u00fctterung und Temperaturabsenkung nach Induktion mit IPTG auf 28\u00b0C konnte erfolgreich in den 30 l-Ma\u00dfstab \u00fcberf\u00fchrt werden, so dass nun ausreichend rekombinantes Enzym f\u00fcr Abbauversuche zur Verf\u00fcgung steht. Die Protease von T. keratinophilus weist mit 54h Halbwertzeit eine mehr als 10fach h\u00f6here Temperaturstabilit\u00e4t als kommerziell erh\u00e4ltliche Proteasen auf und ist damit ideal f\u00fcr die Zielsetzung des umweltschonenden Federabbaus geeignet. Es konnte ein Umsatz von 37 g\/l bei 100 g\/l Federn binnen 24h nachgewiesen werden. Mit den Ergebnissen der Laborversuche zum Federabbau mit direktem Einsatz von Enzymen ist es derzeit noch nicht vor-stellbar, eine Anlage zur biotechnologischen Federverwertung aufzubauen und mit wirtschaftlichem Erfolg zu betreiben, weil die Abbaugrade deutlich unter den angestrebten 90% liegen. Falls diese erreicht werden sollten, bietet sich angesichts der EU-Hygienevorschriften f\u00fcr nicht zum menschlichen Verzehr bestimmte tierische Nebenprodukte vorwiegend der Einsatz als Zuschlagstoff f\u00fcr die Herstellung von Kleintierfutter an.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
–\tKluskens, L.D., Voorhorst, W.G.B., Siezen, R.F., Schwertfeger, R.M., Antranikian, G., van de Oost, J., de Vos, W.M. (2001): Molecular characterization of fervidolysin, a subtilisin-like serine protease from the thermophilic bacterium Fervidobacterium pennivorans. Poster presentation on the Third International Kongress on Extremophiles.
\n–\tRie\u00dfen, S., Antranikian, G. (2001): Isolation of Thermoanaerobacter keratinophilus sp. nov., a novel thermophilic anaerobic bacterium with keratinolytic activity. Extremophiles 5: 399-408.
\n–\tBrodersen, J., Goedde, C., Fuchs, C., Rie\u00dfen, S., Antranikian, G. and M\u00e4rkl, H. (2001): Biotechnologische Verwertung von Abfallfedern mit Hilfe extremophiler Mikroorganismen. Sonderband Biokatalyse der DBU.
\n–\tKluskens, L.D., Voorhorst, W.G.B., Siezen, R.F., Schwertfeger, R.M., Antranikian, G., van de Oost, J., de Vos, W.M. (2002): Molecular characterization of fervidolysin, a subtilisin-like serine protease from the thermophilic bacterium Fervidobacterium pennivorans. Extremophiles 6:185-194.
\n–\tBrodersen, J., Rie\u00dfen, S., Antranikian, G., M\u00e4rkl, H. (2002): From isolation to application: degradation of \u00df-keratin by a novel extremthermophilic bacterium, Thermoanaerobacter keratinophilus. Posterpr\u00e4sentation , Extremophiles 2002.
\n–\tBrodersen, J., Rie\u00dfen, S., Antranikian, G., M\u00e4rkl, H. (2002): Degradation of \u00df-keratine by extremophilic bacteria. Posterpr\u00e4sentation, Biocat 2002.
\n–\tBrodersen, J., Rie\u00dfen, S., Antranikian, G., M\u00e4rkl, H. (2003): Umweltfreundliche Aufbereitung von H\u00fchnerfedern mittels extrem thermophiler Bakterien und thermostabilen Enzymen, Trankskript Sonderband 2003, 17-19. Referenzen
\n–\tBaneyx, F. (1999): Recombinant protein expression in Escherichia coli. Curr. Opin. Biotechnol. Vol. 10: 411-421.
\n–\tFriehs, K.H. (1999): Ma\u00dfnahmen zur Verbesserung der Produktion von rekombinanten Proteinen und Plasmid-DNS. Habilitationsschrift.
\n–\tLee, J. , S.Y., Park, S., Middelberg, A.P.J. (1999): Control of fed-batch fermentations. Biotechnol. Adv. Vol. 17: 29-48.
\n–\tMeinhardt, F., Busskamp, M., Wittchen, K.D. (1994): Cloning and sequencing of the leu C and npr M genes and a putative spo IV gene from Bacillus megatrium DSM 319. Applied Microbiology and Biotechnology 41: 344-351.
\n–\tWittchen, K.D., Meinhardt, F. (1995): Inactivation of the major exracellular protease from Bacillus megaterium DSM 319 by gene replacement. Applied microbiology and Biotechnology 42: 871-877.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Es konnte gezeigt werden, dass Gene aus extremophilen Mikroorganismen, die Proteasen kodieren, erfolgreich aktiv intrazellul\u00e4r in E. coli und Bacillus megaterium exprimiert werden k\u00f6nnen. Damit ist der Weg frei f\u00fcr die geplante in vitro Untersuchung.
\nNachdem mit dem Wildstamm nur f\u00fcr den Laborma\u00dfstab Enzyme f\u00fcr den Federabbau in vitro produziert werden konnten, ist es uns gelungen mit dem rekombinanten E. coli im Fedbatch-Verfahren mit exponenziell gesteuerter F\u00fctterung zu entwickeln, mit dem ausreichende Enzyme produziert werden konnte. Protease von T. keratinophilus weist eine mehr als 10fach h\u00f6here Temperaturstabilit\u00e4t als kommerziell erh\u00e4ltliche Proteasen auf und ist damit f\u00fcr die Zielsetzung des umweltschonenden Federabbaus geeignet. Allerdings lassen sich nur Abbaugrade von 37 % bei 100 g\/l Federn erzielen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens In einem innovativen Verfahren soll durch extremophile Mikroorganismen ein hochwertiger aminos\u00e4uren- und peptidreicher Futtermittelzusatz gewonnen werden. Dabei wird die Entsorgung eines Abfallstoffs mit der Gewinnung eines vermarktbaren Produkts kombiniert und auf \u00f6kologisch und \u00f6konomisch vorteilhafte Weise ein Beitrag zum produktionsintegrierten Umweltschutz geleistet sowie der Vorgabe des Kreislaufwirtschafts- und Abfallgesetzes zur […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[504,47,51,52,53],"class_list":["post-21473","projektdatenbank","type-projektdatenbank","status-publish","hentry","tag-bundesrepublik-deutschland","tag-klimaschutz","tag-ressourcenschonung","tag-umweltforschung","tag-umwelttechnik"],"meta_box":{"dbu_projektdatenbank_az_ges":"13040\/07","dbu_projektdatenbank_medien":"","dbu_projektdatenbank_pdfdatei":"13040-07.pdf","dbu_projektdatenbank_bsumme":"360.044,07","dbu_projektdatenbank_firma":"Technische Universit\u00e4t Hamburg-HarburgArbeitsbereich 2.09Bioproze\u00df- und Bioverfahrenstechnik","dbu_projektdatenbank_strasse":"Denickestr. 15","dbu_projektdatenbank_plz_str":"21071","dbu_projektdatenbank_ort_str":"Hamburg","dbu_projektdatenbank_p_von":"2000-05-01 00:00:00","dbu_projektdatenbank_p_bis":"2003-12-31 00:00:00","dbu_projektdatenbank_laufzeit":"3 Jahre und 8 Monate","dbu_projektdatenbank_telefon":"040\/42878-3017","dbu_projektdatenbank_inet":"","dbu_projektdatenbank_bundesland":"Bundesrepublik Deutschland","dbu_projektdatenbank_foerderber":"38","dbu_projektdatenbank_ab_bericht":"DBU-Abschlussbericht-AZ-13040_07.pdf","dbu_projektdatenbank_ist_nachbewilligung_von":"","dbu_projektdatenbank_hat_nachbewilligung":"","dbu_headerimage_cover":"","dbu_submenu":"","dbu_submenu_position":"","dbu_submenu_entry":[]},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21473","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/projektdatenbank"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21473\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":34476,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21473\/revisions\/34476"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=21473"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=21473"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=21473"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}