Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Zur industriellen Gewinnung definierter Phospholipide verwendet man bisher chemische und zum Teil bereits enzymatische Methoden. Letztere basieren oft auf Enzymen aus S\u00e4ugetieren, z. B. Phospholipase (PLA2) vom Schwein, die aus Sicherheitsbedenken (Virus- und Prioneninfektion) und religi\u00f6sen Vor-behalten (bei j\u00fcdischer und moslemischer Religionszugeh\u00f6rigkeit) wenig Zukunft haben. Im Rahmen des Vorhabens wurde daher die Entwicklung eines Verfahrens zur Gewinnung von rekombinanter PLA2 angestrebt. Dieses Enzym soll die gegenw\u00e4rtig verwendete PLA2 ersetzen und au\u00dferdem die Basis bilden f\u00fcr neue enzymatische Reaktionen (Re- bzw. Transacylierung von Phospholipiden), die die zz. praktizierten chemischen Verfahren ersetzen und somit energie- und umweltfreundlicher gestalten sollen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDas Vorhaben umfasste zwei Teilprojekte:
\n–\tEntwicklung eines Verfahrens zur Gewinnung von rekombinanter PLA2
\n–\tStudien zur enzymatischen Phospholipidtransformation mit PLA2
\nF\u00fcr die L\u00f6sung der ersten Aufgabe wurden zun\u00e4chst mittels PCR-Technik synthetische Genkonstrukte hergestellt, die der Proteinstruktur von PLA2 aus Bienengift (bv-PLA2) entsprechen, an deren N-Terminus jedoch modifiziert sind. Die Expression erfolgte in E. coli, wobei die Enzyme als inclusion bo-dies anfielen. Nach deren Solubilisierung und Renaturierung wurden die Enzyme durch Katione-naustauschchromatographie gereinigt. Eine Ma\u00dfstabsvergr\u00f6\u00dferung und Optimierung der Enzymherstellung wurde im 10-l-Fermenter vorgenommen. Au\u00dferdem wurden 5 Enzymvarianten gewonnen, in denen jeweils eine der f\u00fcnf Disulfidbr\u00fccken der PLA2 durch gerichtete Mutagenese eliminiert wurde.
\nDie Pr\u00fcfung von PLA2 zur Katalyse von Reacylierungsreaktionen erfolgte mit den Enzymen aus Schweinepankreas und Bienengift in Glcerol-Methanol- bzw. Glycerol-Ethanol-Mischungen. Zur Behandlung der Reacylierungssysteme wurden Methoden der statistischen Versuchsplanung erprobt. Mittels eines Plackett-Burman-Versuchsplans wurden die Parameter ermittelt, die auf die Produktausbeute einen signifikanten Einfluss haben. Anschlie\u00dfend wurden diese Parameter nach einem modifizierten D-Optimal-Plan variiert.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Es wurden vier N-terminal modifizierte Varianten der PLA2 aus Bienengift gewonnen, in denen entweder das N-terminale Isoleucin des Wildtyps durch einen Valin- (I1V-PLA2) bzw. Alanin-Rest (I1A-PLA2) ersetzt wurde oder das Enzym durch das Startmethionin (M-PLA2)bzw. einen His-Tag (His6-PLA2) verl\u00e4ngert war. Ausgehend von einer 1-l-Sch\u00fcttelkultur konnten alle Enzyme in elektrophoretisch reiner Form hergestellt werden (Proteinausbeuten f\u00fcr His6-PLA2 4 mg, f\u00fcr I1V-PLA2 und I1A-PLA2 10 mg, f\u00fcr M-PLA2 11 mg). Mit Ausnahme von His6-PLA2 zeigten alle Enzyme die gleiche spezifische Aktivit\u00e4t und die gleichen spektroskopischen Eigenschaften (Circulardichroismus, Fluoreszenz) wie die kommerzielle glykosylierte PLA2 (bv-PLA2), die aus dem Gift der Honigbiene gewonnen wird. Auch die thermodynamische Stabilit\u00e4t der Enzyme war identisch und unterschied sich nicht signifikant von bv-PLA2.
\nF\u00fcr die Enzymvariante I1A-PLA2 wurde im 10-l-Fermenter ein Hochzelldichtefermentationsverfahren auf Mineralsalzmediumbasis entwickelt. Unter optimalen Bedingungen wurde eine Biotrockenmasse von 50 bis 60 g l-1 mit einem Anteil von 15% des rekombinanten Proteins am Gesamtzellprotein erhalten. Es kann abgesch\u00e4tzt werden, dass die Ausbeute an PLA2, bezogen auf 1 l Kulturl\u00f6sung, gegen\u00fcber der Sch\u00fcttelkultur um den Faktor 30 gesteigert wurde.
\nZur Testung der rekombinanten Enzyme wurden dem Industriepartner Proben der Enzyme I1A-PLA2 und I1V-PLA2 zur Verf\u00fcgung gestellt. Alle Enzymproben erwiesen sich als sehr gut geeignet zur Herstellung von Lysophosphatidylcholin (im Grammma\u00dfstab) mit einem Umsatzgrad von > 99 %.
\nDie zus\u00e4tzlich in das Arbeitsprogramm aufgenommene Gewinnung der Disulfid-modifizierten Enzymva-rianten I1A\/C37S\/C63S-PLA2, I1A\/C9S\/C31S-PLA2, I1A\/C61S\/C95S-PLA2, I1A\/C30S\/C70S-PLA und I1A\/C105S\/C113S-PLA2 gelang nach derselben Strategie wie die von I1A-PLA2. In Abh\u00e4ngigkeit von der Lokalisation der entfernten Disulfidbr\u00fccke zeigten die Varianten sehr distinkte Stabilit\u00e4tsunterschiede, so dass eine gezielte Modulation der Enzymstabilit\u00e4t, die zur Vermeidung von Restaktivit\u00e4ten in den mittels PLA2 hergestellten Phospholipidprodukten w\u00fcnschenswert ist, m\u00f6glich wurde.
\nF\u00fcr die Reaktion von 1-Palmitoyl-2-lyso-sn-glycero-3-phosphocholin (Lyso-PC) mit \u00d6ls\u00e4ure, katalysiert durch PLA2 aus Schweinepankreas bzw. Bienengift, wurden 9 Reaktionsparameter nach einem Plackett-Burman-Versuchsplan zur Selektion der Haupteinflussgr\u00f6\u00dfen analysiert. Dabei erwiesen sich in den gew\u00e4hlten Grenzen die Konzentration an Lyso-PC, der Anteil an Cosolvens, die Puffersalzkonzentration und die Temperatur f\u00fcr die Reaktion mit PLA2 aus Schweinepankreas als signifikant, w\u00e4hrend die Haupteinflussfaktoren f\u00fcr die Reaktion mit bv-PLA2 neben der Lyso-PC-Konzentration die Enzymaktivit\u00e4t und die Reaktionszeit waren. Die sich anschlie\u00dfenden Versuche lieferten nach einem modifizierten D-Optimal-Versuchsplan Regressionsgleichungen, die eine Vorhersage der Produktausbeuten f\u00fcr alle Bedingungen innerhalb der gesetzten Grenzen und die Analyse von Interaktionen der Haupeinflussfaktoren erlauben. Die maximalen Produktausbeuten lagen bei Verwendung der PLA2 aus Schweinepankreas bei 70% (nach 18 h), bei Verwendung von bv-PLA2 bei 50 % (nach 144 h).<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Es erfolgte eine Patentanmeldung (Verfahren zur Herstellung von Phospholipase A2). Zwei Dissertationen und zwei Publikationen sind in Vorbereitung. Teilergebnisse wurden bei den DECHEMA-Jahrestagungen der Biotechnologen in Wiesbaden 2002 und in M\u00fcnchen 2003, der Biocat 2002 in Hamburg und dem 2. Innovationskongress Chemie und Biotechnologie 2003 in Halle pr\u00e4sentiert. Eine Vorstellung des Projekts erfolgte in den Publikationen des Verbunds (Faltblatt 2001, Biospektrum 2001, Transkript 2003).<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die beiden Hauptziele des Projekts wurden erreicht. Es wurde ein Verfahren zur Herstellung einer PLA2 entwickelt, das ohne den Kontakt mit tierischen Geweben auskommt und zur Gewinnung von Lysophospholipiden sehr gut geeignet ist. Verhandlungen zur \u00dcberf\u00fchrung in die Industrie wurden aufgenommen. Noch zu pr\u00fcfen ist die Frage der Toxizit\u00e4t der neuen Enzyme.
\nDurch die zur Analyse der Reacylierungssysteme verwendeten Methoden der statistischen Versuchsplanung wurden Grundlagen f\u00fcr eine umfassende Beschreibung und Optimierung dieser Systeme gelegt. Im Vergleich der beiden Enzyme, die f\u00fcr eine industrielle Anwendung in Frage kommen (PLA2 aus Schweinepankreas und PLA2 aus Bienengift), erwies sich erstere hinsichtlich der erreichbaren Produktausbeuten als \u00fcberlegen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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