Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Aufgrund seines breiten Substratspektrums nimmt das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca gottschalkii (vormals bogoriae) eine Sonderstellung unter allen extremophilen Mikroorganismen ein und verf\u00fcgt \u00fcber eine F\u00fclle von biotechnologisch interessanten Enzymen. Ziel des Projekts war es, durch den Einsatz von Biokatalysatoren aus diesem Mikroorganismus nachwachsende Rohstoffe wie St\u00e4rke bzw. Amylopectin und Amylose zu hochwertigen Kohlenhydraten (Cyclodextrine, verzweigte Dextrine und Oligosaccharide) umzusetzen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDas Genom des thermoalkaliphilen Bakteriums Anaerobranca gottschalkii wurde zun\u00e4chst partiell sequenziert. Ziel des Teilprojekts war es, unter geringst m\u00f6glichem Aufwand und innerhalb k\u00fcrzester Zeit alle oder m\u00f6glichst viele Gene des Kohlenhydratstoffwechsels zu identifizieren. Die partielle Genomanalyse erfolgte \u00fcber eine so genannte shotgun-Seqenzierung. Dabei wurde die genomische DNA mechanisch geschert, kloniert und an den Fragmentenden sequenziert. In 14.865 Sequenzierungsans\u00e4tzen wurden 11.634 brauchbare Sequenzen mit einer Rohsequenz von 11,97 Mbp generiert. Die produzierten Sequenzfragmente wurden in einer Datenbank zusammengefasst und assembliert. Anschlie\u00dfend erfolgte die bioinformatische Auswertung \u00fcber eine automatisch vorgenommene und manuell nachbearbeitete Annotation. Sequenzl\u00fccken in biotechnologisch relevanten Genen wurden durch Primerwalking geschlossen. Den Projektteilnehmern wurden Passwortgesch\u00fctzte Zugangsrechte auf den die Sequenzinformationen enthaltenen Server eingerichtet. Mit Hilfe dieser Sequenzinformation wurden Gene ausgew\u00e4hlter Kohlenhydrat-metabolisierender Gene kloniert und exprimiert und die rekombinanten Enzyme gereinigt. Die Substrat- und Produktspektren dieser Enzyme wurden mittels HPLC, High performance anion exchange chromatography (HPAEC), D\u00fcnnschichtchromatographie (DC) und size exclusion chromatography (SEC) charakterisiert. Um die Thermostabilit\u00e4t der CGTase zu erh\u00f6hen, wurden \u00fcber Errorprone PCR Mutationen in das die CGTase kodierende Gen eingef\u00fchrt und die mutierten Gene anschlie\u00dfend \u00fcber DNA-shuffling neu rekombiniert. Die Gen-bank erhaltener, mutierter CGTase-Varianten wurde auf erh\u00f6hte Thermostabilit\u00e4t gescreent. Zur Absch\u00e4tzung der Thermostabilit\u00e4t wurde die Schmelztemperatur verschiedener Mutanten mittels differential scanning calorimetry (DSC) bestimmt. Des Weiteren wurde ein System zur Tat-abh\u00e4ngigen heterologen, sekretorischen Expression etabliert. Dies geschah \u00fcber die Herstellung von Fusionsgenen aus biotech-nologisch interessanten Genen von A. gottschalkii und verschiedenen Signalsequenzen.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Das Genom von Anaerobranca gottschalkii wurde sequenziert. Die 12.355 generierten guten Sequenzen sind in 510 Contigs assembliert. Die Gesamtl\u00e4nge dieser Contigs betr\u00e4gt 1.921.832 bp mit einer Qualit\u00e4t von PHRED 38 (entspricht einem zu erwartenden Sequenzfahler in ca. 8.000 bp). Es wurden ca. 95 % des Genoms bei 3,7-facher Sequenzabdeckung sequenziert. In der letzten Annotationsrunde wurden 1.956 Orf identifiziert. 1541 (78 %) der potenziellen Gene wiesen Homologien zu bereits bekannten Ge-nen auf. Unter ihnen fanden sich 593 potenzielle Membranproteine und insgesamt 93 Gene des Zuckermetabolismus. Mit Hilfe der Sequenzinformationen konnten zwei a-Amylasen, die CGTase, das Verzweigungsenzym und die Pullulanase in E.coli bzw. Staphylococcus carnosus aktiv in aktiver Form exprimiert und gereinigt werden. Mit verschiedenen Methoden wurden die rekombinanten Enzyme charakterisiert. Ebenfalls erfolgreich war die Konstruktion von Fusionsgenen aus den Genen f\u00fcr das Ver-zweigungsenzym bzw. die CGTase und verschiedenen Sekretions-Signalsequenzen. Nach Transformationen der Fusionsgene in Staphylococcus carnosus konnte im \u00dcberstand die jeweilige enzymatische Aktivit\u00e4ten detektiert werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnte daher erstmals in einem Grampositiven Bakterium ein Tatabh\u00e4ngiges Expressionssystem zur sekretorischen Gewinnung von rekombinanten Enzymen etabliert werden.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Ver\u00f6ffentlichungenAntranikian, G., Klenk, H-P., Freudl, R., Sterner, R., Liebl, W. (2001): Extremophile Mikroorganismen als Quelle stabiler Biokatalysatoren. In: Heiden, S., Erb, R. (eds) Biokatalyse Sonderausgabe BIOspektrum and Spektrum Akademischer Verlag, 44-48.
\nBallschmiter, M., Armbrecht, M., Ivanova, K., Liebl, W. (2004): Recombinant production and properties of two a-amylases from Anaerobranca gottschalkii.
\nBertoldo, C., Armbrecht, M., Becker, F., Sch\u00e4fer, T., Antranikian, G., Liebl, W. (2003): Cloning, sequencing and characterization of thermoalkalistable pullulanase type I from Anaerobranca gottschalkii.
\nBlaudeck, N., Sprenger G. A., Freudl, R., Wiegert, T. (2001): Specificity of signal peptide recognition in Tatdependent bacterial protein translocation. J.Bacteriol. 183, 604-610.
\nBiwer, A., Antranikian, G., Heinzle, E. (2002). Enzymatic production of cyclodextrins. Appl. Microbiol. Biotechnol., 59, 609-617.
\nDilsen, S., Paul, W., Sandgathe, A., Tippe, D., Freudl, R., Th\u00f6mmes, J., Kula, M.-R., Takors, R., Wandrey, C., Weuster-Botz, D. (2000): Fed-batch production of recombinant human calcitonin precursor fusion protein using Staphylococcus carnosus as an expression-secretion system. Appl. Microbiol. Biotechnol. 54, 361-359.
\nDilsen, S., Paul, W., Herforth, D., Sandgathe, A., Altenbach-Rehm, J., Freudl, R., Wandrey, C., Weuster-Botz, D. (2001): Evaluation of parallel operated small-scale bubble columns for microbial process development using Staphylococcus carnosus. J.Biotechnol. 88, 77-84.
\nLiebl, W. (2002): Extremophile: Mikroorganismen unter Extrembedingungen. Georgia Augusta 1:98-103.
\nProwe, S. G., Antranikian G. (2001): Anaerobranca gottschalkii sp. nov., a novel thermoalkaliphilic bacterium that grows anaerobically at high pH and temperature. Int. J. Syt. Bacteriol. 45, 457-465.
\nSandgathe, A., Tippe, D., Dilsen, S., Meens, J., Halfar, M., Weuster-Botz, D., Freudl, R., Th\u00f6mmes, J., Kula, M. R. (2003): Prodution of a human calcitonin precursor with Staphylococcus carnosus: secretory expression and single-step recovery by expanded bed adsorption. Process Biochemistry, 38, 1351 – 1361.
\nSterner, R., Liebl, W. (2001): Thermophilic adaptation of proteins. Crit. Rev. Biochem. Mol. Biol. 36, 39-106.
\nThiemann, V., Antranikian, G., Klenk, H.-P., Vollstedt, A., Freudl, R., J\u00fcrgens, C., Sterner, R, Liebl, W. (2003): Das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca gottschalkii als Quelle stabiler Enzyme zur Herstellung hochwertiger Kohlenhydrate. Transkript (Sonderheft Nachhaltige Biokatalyse Heiden, S., Erb, R., Eds.), pp.90 – 93.
\nPr\u00e4sentationen
\nBallschmiter, M., Ivanova, K., Antranikian, G., Liebl, W. (2002): a-amylases from the thermoalkaliphilic bacterium Anaerobranca gottschalkii. Poster, biocat2002, Hamburg, 28.-31.07.2002.
\nBertoldo, C., Liebl, W., Armbrecht, M., Duffner, F., Sch\u00e4fer, T., Antranikian, G. (2002): Purification and characterization of a thermoalkalistable pullulanase type I from the thermophilic anaerobic bacterium Anaerobranca gottschalkii after cloning and expression of its gene in Escherichia coli. Poster, bio-cat2002, Hamburg, 28.-31.07.2002 and 4th International Congress on Extremophiles, Neapel, 22.-26.09.2002.
\nJ\u00fcrgens, C., Prowe, S.G., Thiemann, V., Sterner, R., Antranikian, G. (2003): Purification and characterisation of the native and the heterologously expressed CGTase from the anaerobic thermoalkaliphile Anaerobranca gottschalkii, VAAM Tagung Berlin, 23.-26.03.2003 und 5th Carbohydrate Bioengineering Meeting, Groningen, 06.-09.04.2003.
\nKlenk, H.-P.: Comparative genomics and evolution of extremophiles @ Extremophiles III. Hamburg, September 2000 und Whole genome comparisons @ International Conference on Structural Genomics. Yokohama, November 2000.
\nThiemann, V., Vollstedt, A., Freudl, R., Reisen, M., Saake, B., Puls, J., Antranikian, G. (2002 und 2003): Purification and characterization of the heterologously expressed branching enzyme from the thermoal-kaliphilic bacterium Anaerobranca gottschalkii. Vortrag VAAM Tagung G\u00f6ttingen, 24.-27.04.2002 und Poster biocat2002, Hamburg, 28-31.07.2002, VAAM Tagung Berlin, 23.-26.03.2003 und 5th Carbohydrate Bioengineering Meeting. Groningen, 06.-09.04.2003.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die Meilensteine des Projekts konnten erfolgreich erarbeitet werden. Der wissenschaftliche Output kann wie folgt zusammengefasst werden:
\no 11 Publikationen (davon 8 mit gutachterlicher Praxis)
\no 2 geplante Publikationen
\no 5 Pr\u00e4sentationen auf hochkar\u00e4tigen Veranstaltungen
\no 3 Dissertationen
\no 2 erteilte Patente<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens Aufgrund seines breiten Substratspektrums nimmt das thermoalkaliphile Bakterium Anaerobranca gottschalkii (vormals bogoriae) eine Sonderstellung unter allen extremophilen Mikroorganismen ein und verf\u00fcgt \u00fcber eine F\u00fclle von biotechnologisch interessanten Enzymen. Ziel des Projekts war es, durch den Einsatz von Biokatalysatoren aus diesem Mikroorganismus nachwachsende Rohstoffe wie St\u00e4rke bzw. Amylopectin und Amylose zu […]<\/p>\n","protected":false},"author":0,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[504,47,2422,52,53],"class_list":["post-21471","projektdatenbank","type-projektdatenbank","status-publish","hentry","tag-bundesrepublik-deutschland","tag-klimaschutz","tag-landnutzung","tag-umweltforschung","tag-umwelttechnik"],"meta_box":{"dbu_projektdatenbank_az_ges":"13040\/09","dbu_projektdatenbank_medien":"","dbu_projektdatenbank_pdfdatei":"13040-09.pdf","dbu_projektdatenbank_bsumme":"832.453,80","dbu_projektdatenbank_firma":"","dbu_projektdatenbank_strasse":"Karoxbosteler Weg 7","dbu_projektdatenbank_plz_str":"21218","dbu_projektdatenbank_ort_str":"Seevetal","dbu_projektdatenbank_p_von":"2000-05-01 00:00:00","dbu_projektdatenbank_p_bis":"2003-12-31 00:00:00","dbu_projektdatenbank_laufzeit":"3 Jahre und 8 Monate","dbu_projektdatenbank_telefon":"040 42878-3639","dbu_projektdatenbank_inet":"","dbu_projektdatenbank_bundesland":"Bundesrepublik Deutschland","dbu_projektdatenbank_foerderber":"38","dbu_projektdatenbank_ab_bericht":"DBU-Abschlussbericht-AZ-13040-09.pdf","dbu_projektdatenbank_ist_nachbewilligung_von":"","dbu_projektdatenbank_hat_nachbewilligung":"","dbu_headerimage_cover":"","dbu_submenu":"","dbu_submenu_position":"","dbu_submenu_entry":[]},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21471","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/projektdatenbank"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21471\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":34474,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/21471\/revisions\/34474"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=21471"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=21471"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=21471"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}