Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Durch moderne Methoden der Molekularbiologie kann in kurzer Zeit eine Vielzahl von Variationen von Enzymen erzeugt werden, von deren gezieltem Einsatz man h\u00f6here Wertsch\u00f6pfungen bei reduzierter Umweltbelastung erwartet. In diesem Projekt wurden Systeme etabliert, die es gestatten, biokatalytische Reaktionen mit Umsetzung von Sauerstoff und\/oder S\u00e4ure in gro\u00dfer Zahl zu quantifizieren. Dazu wurden Mikrotiterplatten mit integrierter optischer Sensorik entwickelt und mit pH-Regelung sowie einer angepassten Screening-Methodik eingesetzt. Eine Esterase wurde rationell und evolutiv optimiert. Diese wurde mittels eines Autotransporter-Systems in E. coli an der Oberfl\u00e4che der Zellen exprimert. Das Screening dieser Zellen wird mittels der pH-Sensorplatten durchgef\u00fchrt.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenIn einem Projektteil wurden Mikrotiterplatten mit integrierten Optosensoren f\u00fcr Sauerstoff und pH (Messung von Fluoreszenzabschw\u00e4chung und -abklingzeit) entwickelt. Durch intrinsische Referenzierung sind die Platten kalibrationsarm. Die entwickelten Sensoren wurden charakterisiert anhand der Ansprechzeit, der Reproduzierbarkeit und der Querempfindlichkeit. Die Durchmischung in Mikrotiterplatten wurde durch Analyse von pH-Antworten auf Pulse von Alkali charakterisiert. Enzymatische Reaktionen wurden mittels der immobilisierten Sensoren anhand der pH- oder Sauerstoff\u00e4nderung beobachtet. Zur Bestimmung kinetischer Parameter wurden geeignete Auswertemethoden unter Einsatz mathematischer Modelle erarbeitet, die f\u00fcr das industrielle Screening geeignet sind. Die Esterase EstA von B.gladioli und eine k\u00fcnstlich erzeugte Esterase EsjA wurden evolutiv variiert zum Einsatz als technischer Biokatalysator. Es geht dabei vornehmlich um die Racematspaltung von Estern. Ein Autotransporter-System in E.coli wurde f\u00fcr die Sekretion von Varianten dieser Esterase genutzt. In Verbindung mit den integrierten Platten und den Screening-Methoden ist eine neue Methode unter Verwendung ganzer Zellen zur schnellen Erzeugung und Testung der katalytischen Aktivit\u00e4t von Enzymen etabliert worden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
In diesem Projekt wurden neue Screening-Methoden zur Entwicklung von Enzymen entwickelt. Im Fokus standen dabei vor allem Esterasen, aber auch Sauerstoff verbrauchende Enzyme wie Oxidasen. Einer-seits wurden neue Methoden zur Herstellung von Enzymbibliotheken mit Hilfe des so genannten Surfa-ce-Displays entwickelt. Andererseits wurden neue Screening-Methoden unter Zuhilfenahme von in die-sem Projekt entwickelten Mikrotiterplatten erarbeitet und getestet. Im Projekt wurden 3 Typen von Mikro-titerplatten entwickelt, die inzwischen von der Firma Presens GmbH auf dem Markt angeboten werden. Dazu mussten neue Sensorcocktails und Beschichtungstechniken entwickelt werden. Diese Platten enthalten Sensoren, bei denen jeweils ein geeignetes Referenzfluorophor mit immobilisiert ist. Durch diese Referenzierung ist die Kalibration wesentlich erleichtert. Beim Plattentyp HP96T ist die pH-Messung im Bereich 5-8 mit einer kurzen Ansprechzeit von wenigen Sekunden m\u00f6glich. Interferenzen durch Fluo-rophore im Medium sind bei der optisch isolierten pH-Platte HP96L ausgeschaltet. Da f\u00fcr diese Platte eine etwas dickere Sensorschicht ben\u00f6tigt wurde, ist die Ansprechzeit leicht verl\u00e4ngert. Eingehende Mischungsstudien mit den pH-Platten zeigten, dass die urspr\u00fcnglich vorgesehene Entwicklung einer pH-Stat-Methode, bei der mit Hilfe einer Nanoliter-Pumpe der pH-Wert in den Mikrotiterplatten geregelt werden sollte, in verf\u00fcgbaren Readern nicht realisiert werden kann. Mit der entwickelten pH-Dyn-Methode, bei der durch Einsatz eines geeigneten Puffersystems messbare pH-\u00c4nderungen erhalten werden, kann jedoch die Aktivit\u00e4t von Enzymen, bei deren Einsatz S\u00e4uren produziert oder verbraucht werden, hinreichend genau bestimmt werden. Der Sauerstofftransfer in Mikrotiterplatten unter verschiedenen Bedingungen wurde mit den Sauerstoffplatten OP96F eingehend studiert. Darauf aufbauend wurde eine Screening-Methode f\u00fcr Oxidasen entwickelt und beispielhaft eingesetzt. Die Esterase A von Burgholderia gladioli wurde mittels Autodisplay an der Oberfl\u00e4che von E. coli exprimiert. Die Esterase-Aktivit\u00e4t ganzer Zellen, die EstA an der Oberfl\u00e4che exprimierten, war mit unterschiedlichen Methoden, einschlie\u00dflich der Messung in Sensor-Mikrotiterplatten nachweisbar. Durch rationales Design wurde eine neue Esterase, EsjA, konstruiert und mit Autodisplay an die Zelloberfl\u00e4che von E. coli gebracht. Durch die so erhaltene, stark gesteigerte Enzymaktivit\u00e4t war es m\u00f6glich, die Esterase-Aktivit\u00e4t ganzer Zellen innerhalb weniger Minuten in Sensor-Mikrotiterplatten (MTP) zu messen, womit eine wichtige Voraussetzung zum Screening von Bibliotheken erf\u00fcllt war. Es wurden zwei Zufallsbibliotheken von EsjA durch Error-Prone PCR erzeugt und an der Oberfl\u00e4che von E. coli exprimiert.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Publikationen.
\nJ. Mol. Catal. B: Enz. (2002), Biotechnol. Bioeng. (2001, 2003, Biotechnol. Prog. (2002), Appl. Microbiol. Biotechnol. (2003), transkript (2003), bioforum (2001), biospektrum (2001), J.Dairy Res. (2003), Adv. Biochem.Eng.Biotechnol. (2002), 2 in Ausarbeitung
\nVortr\u00e4ge und Poster. 2001:
\n2ndSymp.Appl.Shaking, N.Y. (1V), Biotrans, Darmstadt (2P), ECB10, Madrid (1P). Jahrestag.Biotechnol., Leipzig (1V), Biotechnica 2001 2002: Adv. course biocatalysis, M\u00e4rz (1V); Biocatalysis 2002, Hamburg (1V+4P); Advanced course on biocatalysis, M\u00e4rz 2002 (1V); Inst. Bio-chemie der Westf\u00e4lischen Wilhelms-Universit\u00e4t M\u00fcnster, 4.07 (1V); GDCH-Abendvortrag, Institut f\u00fcr Chemie und Biochemie, Ernst-Moritz-Arndt-University Greifswald, 8.10. (1V); Fourth Europ.Grad.Student Meeting, Feb., Frankfurt\/Main (1 P); Gemeinsame Jahrestag. der GDCH, FG Medizin. Chemie, DPhG, FG Pharmazeutische Chemie, Travem\u00fcnde (1 P); ESBES4, Delft (1V) 2003: Jahrestag. Biotechnol. 2003 (1V+2P), Biocat 2003, Barcelona (1V), Biotechnica 2003 (1P), Univ. M\u00fcnster (1V), Univ. Greifswald (1V), FH Lausitz (1V), Univ. D\u00fcsseldorf (1V), Univ. Darmstadt (1V).<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Mit den drei neuen in diesem Projekt entwickelten Mikrotiterplatten mit integrierten Sensoren f\u00fcr pH und Sauerstoff k\u00f6nnen Enzymkinetiken bestimmt werden. Diese sind in konventionellen Fluoreszenzreadern direkt einsetzbar und ben\u00f6tigen nur einen minimalen Aufwand f\u00fcr die Kalibrierung. Mit diesen Platten konnten umfangreiche Studien zum Mischen und Sauerstofftransport in Mikrotiterplatten durchgef\u00fchrt werden. Die Platten sind nun kommerziell erh\u00e4ltlich und k\u00f6nnen auch zum Z\u00fcchten von Zellen verschie-denster Art eingesetzt werden. Enzyme k\u00f6nnen mit einem neuen Autotransportersystem in E. coli exprimiert, an die Oberfl\u00e4che sekretiert und dort aktiv pr\u00e4sentiert werden. Mit diesen Zellen wurden nach mo-lekularer Evolution erste Screening-Tests mit den pH-Platten durchgef\u00fchrt. Mit dem Projektabschluss stehen nun neue Werkzeuge f\u00fcr eine effiziente Entwicklung neuer Biokatalysatoren mit entsprechend positiven \u00f6konomischen und \u00f6kologischen Auswirkungen zur Verf\u00fcgung.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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