Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel des Projekts beinhaltet die Etablierung und Optimierung der DNA-Chip Technologie f\u00fcr den Routineeinsatz in Forschungs- und Anwendungsgebieten, wo komplexe Nukleins\u00e4uregemische schnell und umfassend detektiert werden m\u00fcssen. Eine kosteng\u00fcnstige Parallelisierung und Miniaturisierung des DNA-Chips, die die Bearbeitungszeit und die erforderlichen Probenmengen um mehrere Gr\u00f6\u00dfenordnungen reduzieren, bedeuten produktintegrierten Umweltschutz durch Vermeidung bzw. Verringerung von Abfall und sind aus diesen Gr\u00fcnden das prim\u00e4re Ziel des Projekts. Im Zuge der Optimierung von DNA-Chip-Technologie soll ein neues Detektions- und Drucksystem entwickelt werden, das ein einfaches, kosteng\u00fcnstiges und anwendungsorientiertes Verfahren zur Herstellung von DNA-Chips bietet.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Optimierung und die Herstellung von DNA-Chip-Drucksystemen sowie von Chips waren dazu geeignet erg\u00e4nzende Erkenntnisse f\u00fcr die Charakterisierung des \u00dcberflussmetabolismus im E.coli-Stamm \u00fcber Genomweite Expressionsanalyse zu gewinnen. Zur Herstellung von E.coli-DNA-Chips wurden alle Gene dieses Organismus mit spezifischen Primern PCR-amplifiziert. Nach \u00dcberpr\u00fcfung der Identit\u00e4t und des Reinheitsgrads der PCR-Produkte wurden diese mit einem DNA-Chip Roboter auf modifizierten Glasoberfl\u00e4chen immobilisiert. Mit diesen hergestellten Chips wurden die Untersuchungen zur globalen Ver\u00e4nderung der Genexpression von E.coli beim \u00dcberflussmetabolismus durchgef\u00fchrt. Zur Etablierung einer Chip-Hybridisierung zur Analyse von komplexen, prokaryontischen Mischkulturen wurden vorwie-gend molekularbiologische Methoden angewendet. Die Vorraussetzungen f\u00fcr die Chip-Hybridisierungen wurden mit folgenden angewandten Methoden erreicht: Bakterienkultivierung in Fl\u00fcssigmedien, RNA-Isolierung und Konzentrierung, Polyacrylamidgelelektrophorese, cDNA-Synthese, Fluoreszenzmarkie-rung, Pr\u00e4paration der Poly-L-Lysin-Chips und Nachbehandlung der Arrays.
\nIm Zuge der Entwicklung von DNA-Chip-Drucksystemen wurden die etablierten Plasmapolymerisierungs- und plasmaunterst\u00fctztes \u00c4tz-, Verbindungs- und Beschichtungsverfahren verwendet. Dazu geh\u00f6ren LPCVD-Beschichtungsverfahren, Plasmapolymerisierungsmethoden, nasschemische Tiefenstrukturierung in Kaliumhydroxidl\u00f6sung und plasmaunterst\u00fctzte \u00c4tzprozesse.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im J\u00fclicher Teilprojekt gelang die Etablierung und Optimierung von DNA-Fragment-Chips f\u00fcr die Genom-weite Expressionsanalyse. Zun\u00e4chst wurde die Analysetechnik f\u00fcr den Modellorganismus Escherichia coli validiert und lieferte sowohl innerhalb dieses Teilprojekts als auch projekt\u00fcbergreifend neue Ans\u00e4t-zen f\u00fcr die Optimierung der Stoffwechselleistung dieses Bakteriums im Hinblick auf seine biotechnologische Anwendung. Im Einzelnen sind die folgenden Punkte erreicht worden:
\n1. Bereitstellung das gesamte E. coli-Genom umfassender DNA-Fragment-Chips
\n2. Validiertes Protokoll f\u00fcr Genomweite Expressionsanalysen mit E. coli-DNA-Chips 3. Identifizierung von E. coli-Genen, deren Expression a) bei Kohlenstoff-Limiterung oder b) bei \u00dc-berflussmetabolismus durch Phosphat-Limitation oder c) bei \u00dcberflussmetabolismus durch Sulfat-Limitation ver\u00e4ndert ist. Die Teilziele wurden im Wesentlichen erreicht und dar\u00fcber hinaus wurde das Acetat-Stimulon, d.h. die Gruppe an Genen, deren Expression durch die Anwesenheit des \u00dcberflussmetaboliten Acetat ver\u00e4ndert wird, identifiziert.
\n4. Neue Ansatzpunkte f\u00fcr die Stamm-Optimierung bei der Pyruvat-Produktion mit E. colia) Identifizierung von E. coli-Genen, deren Expression sich mit den Phasen der Pyruvat-Produktion ver\u00e4ndert
\nb) Genom-umfassende Charakterisierung der Auswirkungen von Gen-Inaktivierungen, die zum metabo-lic design von Pyruvat-Produktionsst\u00e4mmen durchgef\u00fchrt wurden. Innerhalb dieser Zusammenarbeit gelang es die Genexpressionsunterschiede zwischen St\u00e4mmen, die sich in ihrer Pyruvatproduktionskapa-zit\u00e4t unterschieden, zu identifizieren. Diese Arbeiten lieferten neue Anhaltspunkte zur Optimierung der Pyruvatproduktion mit E. coli.
\nZiel des Teilprojekts der Technischen Mikrobiologie ist die Etablierung eines Oligonukleotid-Chip-Prototyps, der die Detektion und Identifikation von bierkontaminierenden Bakterien erm\u00f6glicht, um im Fall einer Kontamination rechtzeitig korrigierend in den Prozess eingreifen zu k\u00f6nnen. Der Schwerpunkt des Teilprojekts liegt in der Entwicklung eines bedarfsorientierten und anwenderfreundlichen Systems zur Routineanalyse, das nach der Entwicklung vom Prototypen zum gebrauchsfertigen Endprodukt, die momentan obligatorischen und zeitaufw\u00e4ndigen Methoden der Kultivierung und Polymerase-Ketten-Reaktion (PCR) ersetzen soll. Erlaubt wird dies durch die Kombination verschiedener Parallelanalysen auf einem Chip, die sowohl das Vorhandensein als auch die Lebensf\u00e4higkeit der kontaminierenden Bakterien anzeigen.
\nZiel des Teilprojekts des AB Mikrosystemtechnik ist ein schnelles und Rohstoffeinsatz verminderndes Drucksystem f\u00fcr DNA-Chips zu entwickeln. Daf\u00fcr sollen mit Hilfe der in der Mikrosystemtechnik etablierten Methoden ein multifunktioneller Druckkopf und ein dazugeh\u00f6riger Basis-Chip mit modifizierter Oberfl\u00e4che hergestellt werden.
\nEs wurden die plasmapolymerisierten Schichten f\u00fcr hydrophobe Oberfl\u00e4chen aus Tetrafluorethylen getestet und f\u00fcr den Einsatz auf Basis-Chip (Glas) optimiert. Die Strukturierung der Schicht f\u00fcr \u00fcbersprechfreie Medien\u00fcbertragung ist gelungen. Durch ein neues, gemeinsam mit Fa. SLS konzipiertes und im AB Mikrosystemtechnik realisiertes thermopneumatisches Antriebsprinzip wurde eine signifikante Miniaturisierung und die komplette Integration der einzelnen elektrischen und Fluidik-Komponenten des Druckkopf-Chips als ein einheitliches System erreicht. Das Druckkopf-Konzept eines Zwei-Fluidiknetz-Systems erwies sich als nichtinvarsiv gegen\u00fcber des DNA enthaltendes Mediums.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Es wurden 6 begutachtete und 3 nichtbegutachtete Publikationen ver\u00f6ffentlicht. Die Projektergebnisse wurden auf 5 Postern bei Fachtagungen der DECHEMA oder der VAAM pr\u00e4sentiert und waren Gegenstand von 10 Vortr\u00e4gen in Industrie und Wissenschaft, davon 5 im Ausland (Brasilien, Indien, Korea, Nie-derlande, Schweiz).<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Wie im Antrag geplant, gelang es die DNA-Chip-Technik f\u00fcr den Modellorganismus E. coli zu etablieren und zur Charakterisierung des Acetatstresses und der aeroben Acetatbildung erfolgreich einzusetzen.
\nDie in dem Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, dass neben den durch die Miniaturisierung bedingten rein quantitativen Vorteilen, die DNA-Chip-Analysen auch qualitativ eine neue Ebene bei der funktionellen Untersuchung von Genen er\u00f6ffnen. Au\u00dferdem vertieft der Einsatz der neuen DNA-Chip-Technik das Wissen \u00fcber zellul\u00e4re Systeme und bietet damit ein gro\u00dfes Potenzial zur Optimierung insbesondere der biotechnologischen Prozesse, in denen Zellen als Biokatalysatoren wirksam sind.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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