Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Eine kommerzielle Nutzung mikrobiell erzeugter Produkte, wie Polyhydroxyalkanoaten (PHA), im Sinne einer Umweltvorsorge erscheint auf Grund ihrer Eigenschaften, insbesondere wegen ihrer biologischen Abbaubarkeit, und ihrer vielseitigen Anwendungsm\u00f6glichkeiten sinnvoll und notwendig. Sie so preiswert zu produzieren, dass sie in der Konkurrenz mit eingef\u00fchrten Kunststoffen wie Polypropylen oder Polyethylen bestehen, ist eine gro\u00dfe Herausforderung an bio-, natur- und ingenieurwissenschaftliche Disziplinen. Weltweit werden Anstrengungen unternommen, dieses Ziel zu erreichen. Sie bestehen in der weiteren Optimierung vorliegender innovativer Verfahren sowie bekannter bakterieller Produzenten und im Screening nach neuen Produzenten. Dabei stellt sich die Frage, wie gut es gelingt, Organismen, die sich bereits in anderen biotechnischen Prozessen bew\u00e4hrt haben und Vorz\u00fcge aufweisen, f\u00fcr die Synthese von PHA durch gentechnische Ma\u00dfnahmen aufzubereiten. Dazu z\u00e4hlt unter anderem die Backhefe Saccharomyces cerevisiae. Sie zur PHA(B)-Synthese zu bef\u00e4higen, zu der sie als Wildtyp nicht in der Lage ist, wurde bereits erprobt. Dieser Projektvorschlag favorisiert zwei sog. nicht konventionelle Hefen: Arxula adeninivorans, die molekularbiologisch sehr gut untersucht ist und wof\u00fcr ein Expressionssystem vorliegt, und die oleogene Hefe Debaryomyces hansenii, letztere, da sie bereits \u00fcber eine metabolisch-regulatorische Pr\u00e4-Disposition verf\u00fcgen d\u00fcrfte. Aufgabe war es, I) durch transformative \u00dcbertragung diese Spezies zur PHB-Synthese zu bef\u00e4higen, II) die Expression und Leistung(sf\u00e4higkeit) der Transformanten zu analysieren und iii) Methoden zum Aufschluss der Zellen und damit zur Gewinnung von PHA zu erproben.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenI): Die einzelnen PHB-Gene von R. eutropha (\u00df-Ketothiolase, Acetoacetyl-CoA-Reduktase, PHB-Synthase)bzw. das PHB-Synthasegen von M. extorquens wurden sowohl in die Hefe Saccharomyces cerevisiae als Hefe-Modellsystem als auch in Arxula adeninivorans (als einem Modellobjekt f\u00fcr die heterologe Expression in einem Nicht-Saccharomyces-Stamm) und in die Fetthefe Debaryomyces hansenii \u00fcbertragen und dort exprimiert. Durch Nutzung verschiedener Arxula-St\u00e4mme lie\u00df sich ein m\u00f6glicher Einfluss der Zellmorphologie auf die Produktbildung untersuchen. F\u00fcr die Expression in Debaryomyces hansenii mu\u00dfte zun\u00e4chst ein Expressionssystem entwickelt werden. Neben dem Nachweis der Aktivit\u00e4ten der PHB-Enzyme wurde PHB nachgewiesen. Die Untersuchungen zur Expression in D. hansenii wurden, wie bei A. adeninivorans beschrieben, durchgef\u00fchrt. und
\nII): Die rekombinanten Hefen A. adeninivorans D. hansenii wurden batchwise und kontinuierlich vermehrt und die Produktbildung versucht zu provozieren bzw. zu stimulieren.
\nDie Experimente wurden in Sch\u00fcttelkolben und in Bioreaktoren (Fermentoren) durchgef\u00fchrt, nur wenige im zig-Liter-Ma\u00dfstab. Die Ergebnisse im kleinen (Labor-)Ma\u00dfstab lie\u00dfen dieses nicht angezeigt er-scheinen. Analysiert wurden die spezifische Wachstumsrate, die spezifische Produktbildungsrate, die Ausbeute an Biomasse und PHB sowie die Polymerkonzentrationen bei Verwendung verschiedener Kohlenstoffquellen. Weiterhin wurde unter Nutzung von Effektoren versucht zu kl\u00e4ren, welche Stoffwechselwege mit der PHB-Synthese konkurrieren (Frage nach dem Bildungsweg f\u00fcr den PHB-Pr\u00e4kursor 3-Hydroxybutyryl-CoA) und ob Konkurrenzen zur\u00fcckgedr\u00e4ngt werden k\u00f6nnen. Gleichzeitig wurde das gebildete Polymer hinsichtlich seiner Zusammensetzung gaschromatographisch analysiert. III): Zur Gewinnung des intrazellul\u00e4r gebildeten wie deponierten Polymers ist es notwendig, die Zellen zu desintegrieren. Versuche zum Zellaufschluss wurden durchgef\u00fchrt. Benutzt wurde der f\u00fcr Bakterien entwickelte sog. CEA (Chemisch-Enzymatischer Aufschluss).<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Saccharomyces cerevisiae ist erfolgreich manipuliert worden (LEAF et al., 1996, POIRIER et al., 2001). Sie ist auch von uns genotypisch modifiziert worden. Es ist gelungen, die drei erforderlichen Gene von Ralstonia eutropha bzw. Methylobacterium extorquens einzeln in dieser Hefe zu etablieren. Eine PHB-Bildung, wenn auch in einem \u00f6konomisch noch nicht relevanten Ma\u00dfe, konnte bei der rekombinanten Hefe, die das bakterielle phb-Synthasegen tr\u00e4gt, festgestellt werden. Um die Konzentration gebildeten Polymers wie auch dessen Synthesegeschwindigkeit zu erh\u00f6hen, war es notwendig, die drei phbB-Synthesegene als Kassette gemeinsam zu exprimieren. Diese wurden unter Nutzung des Vektors pESC-Leu, der die Gene in den Kassetten GAL1-Promotor-phbA-(bzw. phbB-) Gen-CYC-Terminator enth\u00e4lt, konstruiert und zusammen mit dem das phbC-Gen tragenden Vektor pYES2 in die Hefe transformiert. Die entstehenden Transformanten wurden hinsichtlich der Enzymaktivit\u00e4ten der f\u00fcr die PHB-Bildung relevanten Enzyme und mittels Northern-Blot-Analyse charakterisiert und zu Untersuchungen der Produktbildung eingesetzt. Durch die Isolation des rekombinanten Proteins zus\u00e4tzlich zu der in Saccharomyces vorhandenen NADPH:Acetoacetyl-CoA Reduktase konnte ein weiterer Beweis f\u00fcr die Ex-pression des phbB-Gens aus R. eutropha in S. cerevisiae Cl3ABYS86 geliefert werden.
\nEs ist auch gelungen, die genetische Information zur Synthese von PHB in Spezies der Gattungen Arxu-la und Debaryomyces zu transformieren und aktiv zu exprimieren. Zur Transformation in Arxula wurde eine Kassette im Vektor pAL-HPH1, welche aus dem TEF1-Promotor aus A. adeninivorans (Translokati-onselongationsfaktor EF-1??dem HPH Gen von E. coli, (Hygromycin B Resistenz) und dem PHO5-Gen von S. cerevisiae (Transkriptions-Terminations-Region) besteht, ausgew\u00e4hlt. Die Expression des Gens f\u00fcr die Reduktase konnte durch Messung der entsprechenden Enzymaktivit\u00e4t und die Northern-Blot-Analyse nachgewiesen werden. Zur Expression der phb-Gene in Debaryomyces wurde ein neues Wirts-Vektor-System unter Nutzung des Vektors pAL-HPH1 etabliert. Von den konstruierten Transformanten von D. polymorphus und D. hansenii wurden die Hygromycin B-Resistenz ermittelt sowie der Integrati-onsort des Plasmides pAL-HPH1 in der chromosomalen DNA und die mitotische Stabilit\u00e4t des Plasmides in den Transformanten bestimmt. Anschlie\u00dfend wurden die phb-Gene in D. hansenii und D. poly-morphus transformiert. In allen Transformanten konnte die Expression der Gene durch Messung der entsprechenden Enzymaktivit\u00e4ten und Northern-Blot-Analyse belegt werden. Auch die Debaryomyces-Transformanten erwiesen sich als zur Biopolyester-Synthese f\u00e4hig.
\nDie Parameter, die ma\u00dfgeblich die \u00d6konomie bestimmen – Ertragskoeffizient, Geschwindigkeit, Gehalt in der Zelle\/Biomasse – sind in allen transgenen Hefen noch unbefriedigend. Die Transformanten k\u00f6n-nen mit den bakteriellen Wildtypen (noch) nicht konkurrieren. Die Gr\u00fcnde sind noch unklar. PHB wird von Wildtypen (vermehrt) gebildet, wenn Wachstum und Vermehrung limitiert sind (s. o.). Der Stoffwechsel ist weniger komplex und auf die Synthese weniger Produkte eingeschr\u00e4nkt. Je fokussierter der Stoffwechsel ist, um so mehr n\u00e4hert sich der Ertragskoeffizient dem Stoffwechsel bedingt m\u00f6glichen. Bei Organismen, die durch genotypische Ma\u00dfnahmen zur Bildung fremder Produkte bef\u00e4higt wurden, ist der Kohlenstofffluss so nicht kanalisiert. Sofern das nicht autogen geschieht, sind geringere Ausbeuten programmiert. F\u00fcr die hier vorgestellten Transformanten d\u00fcrfte dies zutreffen. Mit Blick auf Produktivit\u00e4t und \u00d6konomie eines Verfahrens l\u00e4sst sich sagen, dass (intrazellul\u00e4re PHB-)Konzentration und spezifische Synthese-Geschwindigkeit st\u00e4rker Einfluss nehmen als der Wirkungsgrad. Bekannt geworden sind bisher Konzentrationen um 0,5 % i.Tr., die von uns erreichten ca. 7 % sind ca. 10fach h\u00f6her, aber nur 1\/10 dessen, was mit Bakterien m\u00f6glich ist.
\nDie gew\u00e4hlten Hefen d\u00fcrften zu \u00e4hnlichen Produktbildungsraten in der Lage sein, wie die bekannten bakteriellen PHB-Produzenten. Theoretische Betrachtungen, die auf quantitativen Parametern f\u00fcr Wachstum und overflow metabolism basieren, st\u00fctzen diese Aussage. Die spezifischen Aktivit\u00e4ten der drei Enzyme sind sehr hoch, gemessen an den Aktivit\u00e4ten, die theoretisch n\u00f6tig sind, um bestimmte, \u00f6konomisch in-teressante Geschwindigkeiten zu realisieren. Sie versprechen mehr, als wirklich erreicht worden ist. Dass die experimentell gefundenen Vermehrungsgeschwindigkeiten und Ertragskoeffizienten deutlich kleiner sind, als die h\u00e4ufig publizierten, die zur Berechnung herangezogen worden sind, ist sicher der Tatsache geschuldet, dass die Bedingungen nicht auf die jeweilige Spezies zugeschnitten worden sind. Wie effizient und mit welcher Geschwindigkeit Debaryomyces sp. und Arxula sp. zu wachsen verm\u00f6gen, konnte noch nicht gekl\u00e4rt werden. Weitere Arbeiten zur geno- wie ph\u00e4notypischen Optimierung sind er-forderlich. Zu kl\u00e4ren ist, u.a. wie wichtig und unverzichtbar Phasine sind, oder allgemeiner, welche Rolle Kompartmentierung spielt, ob die Kunstprodukte (transgene Produzenten) auch mit der F\u00e4higkeit zur Mobilisierung von PHB ausgestattet werden m\u00fcssen und wie langzeit-stabil sie sind, und au\u00dferdem, ob und durch welche (ph\u00e4notypischen) Ma\u00dfnahmen die Parameter, die die \u00d6konomie bestimmen, verbessert werden k\u00f6nnen, will auch hei\u00dfen, ob der Stofffluss auf das eigentliche target fokussierter gef\u00fchrt werden kann. Anhand der bisher erzielten Erkenntnisse kann der Flaschenhals noch nicht lokalisiert werden.
\nIntrazellul\u00e4re Produkte zu gewinnen, setzt Aufschluss der Produzenten voraus. Eine f\u00fcr Bakterien entwickelte Methode zur Desintegration bzw. zum Aufschluss der Zellen und zur Gewinnung von PHA wurde f\u00fcr die Spezies der Gattungen Saccharomyces, Arxula und Debaryomyces getestet. Es konnte gezeigt werden, dass dieses Prinzip auch f\u00fcr Hefen geeignet ist. Diese Methode, die pH-abh\u00e4ngige Reaktionen und enzymatisch katalysierte Hydrolyse kombiniert und nicht auf Extraktion mit organischen L\u00f6sungsmitteln setzt, funktioniert; sie muss jedoch noch auf Hefen angepasst und f\u00fcr sie optimiert werden.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
BREUER, U., F\u00d6LLNER, C.G., KUNZE, G., BABEL, W. (2000): PHA production with a genetically modi-fied yeast – an alternative to the procaryotes? Fr\u00fchjahrstagung der VAAM, M\u00fcnchen, Germany, 12.-16.03.2000. Biospektrum\/Sonderheft: 95
\nBREUER, U., KUNZE, G., BABEL, W. (2000): Biopolymer production with transgenic yeasts? 8th Interna-tional Symposium on Biological Polyesters, Boston, USA, 11.-15.09.2000
\nKUNZE, G., BABEL, W., TERENTIEV, Y., WARTMANN, T., BREUER, U., HUTARDO-PICO, A., BERG-MANN, H. (2000): Wirts-Vektor-System f\u00fcr die heterologe Genexpression in der Hefe Debaryomyces. DE-Patent 100 60 133.2
\nTERENTIEV, Y., B\u00d6ER, E., BREUER, U., BABEL, W., KUNZE, G. (2001): Recombinant yeasts as hosts for the production of poly-3-hydroxybutyrate. 21st ISSY 2001, Lviv, Ukraine, 21.-25.08.2001
\nTERENTIEV, Y., B\u00d6ER, E., BREUER, U., BABEL, W., KUNZE, G. (2001): Recombinant yeasts as hosts for the production of poly-3-hydroxybutyrate. Mycologie-Tagung, Jena, Germany, 01.-03.10.2001
\nBREUER, U., BABEL, W., TERENTIEV, Y., KUNZE, G. (2002): Saccharomyces cerevisiae as a model system showing the capability of yeasts for a PHA production. Workshop Biopolymers: Limits of Natural Performances & Prospects for Overcoming, Leipzig, 30.-31.5.2002
\nBREUER, U., TERENTIEV, Y., KUNZE, G., BABEL, W. (2002): Yeast as producers of polyhydroxyalka-noates: Genetic engineering of Saccharomyces cerevisiae. Macromol. Biosci., 2, 380-386.
\nTERENTIEV, Y., BREUER, U., BABEL, W., KUNZE, G. (2002): Non-conventional yeasts as hosts for the production of polyhydroxybutyrate. Workshop Biopolymers: Limits of Natural Performances & Prospects for Overcoming, Leipzig, 30.-31.5.2002.
\nTERENTIEV, Y., BREUER, U.; B\u00d6ER, E.; BABEL, W., KUNZE, G. (2002): Production of polyhydroxybutyrate by non-conventional yeasts. In: ISBP 2002 International Symposium on Biological Polyesters, M\u00fcnster, 22.-26.09.2002, SL15, Abstractband: 71<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die in dem Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, dass es durch gentechnische Modifikation gelingt, nicht nur Saccharomyces cerevisiae, sondern auch Hefen der Gattungen Arxula und Debaryomyces zur PHA-Produktion zu bef\u00e4higen. Die Etablierung der genetischen Information zur Synthese des gew\u00fcnschten Produktes und aktive Expression der in die Synthesesequenz unmittelbar eingeschlossenen Enzyme sind notwendige Voraussetzungen, offenbar aber nicht hinreichend. Hinsichtlich einer \u00f6konomischen Herstellung des Polymers sind weitere Manipulationen notwendig. Um sie gezielt durchzuf\u00fchren zu k\u00f6nnen, sind Kenntnisse \u00fcber Flaschenh\u00e4lse erforderlich.
\nWeitere Untersuchungen – physiologisch-biochemischer und technologischer Art – sind notwendig, um Hefen als Produktionssysteme f\u00fcr PHA zu qualifizieren. Gemessen am internationalen Stand sind die Ergebnisse herausragend, an der \u00f6konomischen Zielstellung nicht befriedigend. In der Regel ist mehr Potential und Zeit n\u00f6tig, um ein technologisch und \u00f6konomisch relevantes, d. h. anspruchsvolles Ergeb-nis zu erzielen. Die Arbeiten werden auch \u00fcber das Projekt hinaus weiter verfolgt werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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