Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ziel des Vorhabens war die Entwicklung einer neuen Methode zur gezielten Erfassung von luftgetragenen Mikroorganismen-Emissionen aus Bioabfallbehandlungsanlagen. Mikrobielle Emissionen stellen eine relevante Belastung f\u00fcr Mensch und Umwelt im Umfeld von Kompostwerken dar. Klassische Methoden der Analyse von luftgetragenen Organismen erfassen lediglich die vermehrungsf\u00e4hige Fraktion. Anzahl und Art der Mikroorganismen sollten mit direkten fluoreszenzmikroskopischen Analysen ermittelt werden. Angestrebt war die Entwicklung routinem\u00e4\u00dfig durchf\u00fchrbarer Verfahren zur Bestimmung der Gesamtzellzahl und zur kultivierungsunabh\u00e4ngigen Erfassung von Leitorganismen durch in situ-Hybridisierung mit spezifischen Nukleins\u00e4uresonden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenF\u00fcr die Sammlung der Aerosole waren geeignete Sammelger\u00e4te zu ermitteln. Die Luftproben wurden w\u00e4hrend verschiedener Aerosol bildender Aktivit\u00e4ten in einer Kompostierungsanlage mit Filtrationssammlern, Impinger und Impaktor gesammelt. Zur Erfassung der Gesamtzellzahl wurden die Zellen auf Filtern mit einem DNS-spezifischen Farbstoff (DAPI) visualisiert. Die spezifische Detektion von Leitorganismen aus dem Kompostbereich sollte durch Fluoreszenz-in situ-Hybridisierung (FISH-Technik) geschehen. Dazu wurden spezifische rRNS-gerichtete Oligonukleotidsonden f\u00fcr ausgew\u00e4hlte thermophile Aktinomyzeten entworfen und ihre stringenten Hybridisierungsbedingungen experimentell \u00fcberpr\u00fcft. Die FISH-Methode musste f\u00fcr den Nachweis von luftgetragenen Aktinomyzeten spezifisch modifiziert werden, insbesondere durch die Entwicklung spezieller Permeabilisierungsverfahren f\u00fcr die Zellw\u00e4nde. Einige der neuen Oligonukleotidsonden wurden als PCR-Primer eingesetzt. Die Bedingungen f\u00fcr den spezifischen Einsatz in der PCR (Polymeraseketten-Reaktion) wurden mit extrahierter DNA aus Positiv- und Negativkontrollst\u00e4mmen f\u00fcr Thermoactinomyces- und Saccharomonosporaspezifische Primer ermittelt. Nach einem auf Kompostproben ausgerichteten DNA-Extraktions-Protokoll wurde DNA aus Kompost- und Luftproben von Kompostierungsanlagen mittels PCR unter Verwendung des TAM-Primers untersucht. Mit PCR-Amplifikaten (TAM-Primer) der DNA-Extrakte aus einer Mischprobe verschieden alter Komposte wurden Klone hergestellt, deren Sequenzen analysiert und mit Referenzsequenzen verglichen wurden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Filtration und Impingement waren im Rahmen der vorliegenden Gegebenheiten f\u00fcr die Aerosolsammlung vergleichbar gut geeignet. Durch DAPI-F\u00e4rbung der aus Aerosolen gesammelten Zellen, lie\u00df sich die Gesamtzellzahl unabh\u00e4ngig vom Sammelverfahren direkt, einfach und schnell bestimmen. Im Ver-gleich zu kultivierungsabh\u00e4ngigen Detektionsverfahren werden hierbei auch tote sowie lebende, aber nicht vermehrungsf\u00e4hige Zellen, erfasst und im Mittel um eine Zehnerpotenz h\u00f6here Zellzahlen ermittelt. F\u00fcr den spezifischen Nachweis thermophiler Aktinomyzeten wurden f\u00fcr die Gattungen Thermoactinomyces, Saccharomonospora und Nocardiopsis genusspezifische, f\u00fcr die Art Saccharopolyspora rectivirgula speziesspezifische und f\u00fcr ausgew\u00e4hlte thermophile Streptomyzeten gruppenspezifische 16S rRNS-gerichtete Oligonukleotidsonden entworfen. F\u00fcr alle Sonden wurden die erforderlichen stringenten Hybridisierungsbedingungen experimentell ermittelt. Um die rigide Zellwand der Aktinomyzeten f\u00fcr die FISH-Sonden permeabel zu machen, wurde ein schnell durchf\u00fchrbares Lyseverfahren, das 1,0 M HCl verwendet, entwickelt. Derart wurde die Anwendung der FISH-Technik bei jungen Zellen von 9 getesteten Aktinomyzeten-Gattungen m\u00f6glich. F\u00fcr \u00e4ltere Aktinomyzetenzellen und Sporen konnte dagegen noch kein einheitliches, ausreichend wirksames Lyseverfahren entwickelt werden. Aus diesem Grund war ein routinem\u00e4\u00dfiger Nachweis von thermophilen Aktinomyzeten in Aerosolproben von Kompostie-rungsanlagen, in denen in den meisten F\u00e4llen das Vorkommen von \u00e4lteren Zellen und Sporen \u00fcberwiegt, mit der FISH-Technik noch nicht problemfrei m\u00f6glich. Thermoactinomyces- und Saccharomonospora-spezifische Gensonden wurden zudem als Primer in einer PCR eingesetzt und die spezifischen Annealing-Temperaturen f\u00fcr beide Primer mit Kontrollst\u00e4mmen bestimmt. In 6 von 8 Kompost- und 3 von 5 Luftproben einer Kompostierungsanlage konnte mit dem entwickelten Thermoactinomyces-spezifischen Primersystem das Vorkommen von Organismen der Gattung Thermoactinomyces nachgewiesen wer-den. Die Thermoactinomyces-spezifischen 16S rDNA-Abschnitte aus DNA-Extrakten einer Mischprobe verschieden alter Komposte wurden mittels PCR amplifiziert und das Amplifikat anschlie\u00dfend kloniert. Die Sequenzen aller erhaltenen Klone lie\u00dfen sich zweifelsfrei der Gattung Thermoactinomyces zuord-nen und best\u00e4tigten damit nochmals die hohe Spezifit\u00e4t dieses Oligonukleotids.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Das Projekt wurde in Form wissenschaftlicher Poster bei den VAAM-Jahrestagungen 2001 und 2003, sowie bei dem 2nd European Symposium on Aerobiology 2000, dem 12th International Symposium on the Biology of Actinomycetes 2001, der 9th Conference of the Gesellschaft f\u00fcr Hygiene und Umweltmedizin 2001, dem 7th World Congress on Biosensors 2002 und dem 1st FEMS Congress of European Microbio-logists 2003 pr\u00e4sentiert. In Vortr\u00e4gen wurde das Projekt 2000 auf dem 2nd European Symposium on Aerobiology, der Konferenz Microbiology of Composting and other thermogenic bioprocesses und 2004 auf der VAAM-Jahrestagung vorgestellt. Neben der Publikation von Neef, A., Sch\u00e4fer, R., Beimfohr, C. und K\u00e4mpfer, P. (2003): Fluorescence based rRNA sensor systems for detection of whole cells of Saccharomonospora spp. and Thermoactinomyces spp.; (Biosensors and Bioelectronics, 18, 565-569) sind f\u00fcr 2004 noch folgende Publikationen geplant: Development of rRNA-targeted oligonucleotide probes for the detection of thermophilic actinomycetes originating from composting facilities und Specific PCR assay for detection of Thermoactinomyces in compost material and aerosols originating from compost plants.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
F\u00fcr die Gesamtzellzahlermittlung in der Luft von Kompostierungsanlagen steht mit DAPI-F\u00e4rbung und Fluoreszenzmikroskopie eine schnelle, sichere und mit geringem Materialaufwand durchf\u00fchrbare Detektionsmethode zur Verf\u00fcgung. Mit Anwendung des Lyseprotokolls f\u00fcr j\u00fcngere Aktinomyzetenzellen lassen sich mit den neu entworfenen rRNA-gerichteten Gensonden j\u00fcngere Zellen von Thermoactinomyces, Saccharomonospora, Nocardiopsis, Saccharopolyspora rectivirgula und ausgew\u00e4hlte thermophile Streptomyzeten spezifisch nachweisen. F\u00fcr die Permeabilisierung \u00e4lterer Aktinomyzetenzellen und Sporen besteht noch Entwicklungsbedarf. Die in dem Projekt entwickelten Nachweissysteme f\u00fcr Saccharomonospora und Thermoactinomyces mittels PCR k\u00f6nnen direkt von Umwelt- und Diagnostik-Laboratorien angewendet werden. Bei Anwendung dieser Systeme mit der Realtime-PCR lie\u00dfe sich der Nachweis von Thermoactinomyces auch quantitativ und schnell mit einer gr\u00f6\u00dferen Probenzahl f\u00fchren.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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