Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Ein Verfahren zur Produktion des Enzyms Phytase f\u00fcr den Einsatz im Lebensmittelbereich soll auf Basis optimierter Hochleistungskultivierungen von Bakterien entwickelt werden. Das Enzym spaltet Phytins\u00e4ure, wodurch die Nutzung sowohl des Phosphat- als auch Zuckeranteils von N\u00e4hrstoffen und Futtermitteln verbessert wird. Im Sinne eines produktionsintegrierten Umweltschutzes f\u00fchrt dies zur Schonung energetischer und stofflicher Ressourcen. Dabei werden in einer Kooperation zwischen Universit\u00e4t und einer mittelst\u00e4ndischen Firma technische Neuerungen erarbeitet, die sich durch deutliche Umweltentlastungseffekte auszeichnen und sich vom derzeitigen Stand der Produktionsverfahren deutlich unterscheiden.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDas Projekt umfasst die Konstruktion eines optimierten Produktionsstamms f\u00fcr eine bakterielle Phytase, die in der Gruppe von Dr. Greiner an der Bundesforschungsanstalt f\u00fcr Ern\u00e4hrung in Karlsruhe erstmalig isoliert wurde. Erhebliche umweltrelevante Verbesserungen sollen dadurch erreicht werden, indem diese Phytase w\u00e4hrend ihrer Produktion ins Medium ausgeschleust wird. Dadurch k\u00f6nnen h\u00f6here Produktivit\u00e4ten erzielt (Ressourcen- & Energieeinsparung) und die Reinigung des Enzyms kann erheblich umweltschonender durchgef\u00fchrt werden, als dies in den bisher \u00fcblichen Prozessen m\u00f6glich ist. Ein Hauptteil der Arbeit besteht in der Entwicklung eines effektiven Produktionsprozesses. Dazu sollen Hochzelldichteverfahren entwickelt werden. Derartige Verfahren erlauben eine bessere Auslastung der Produktionsanlagen, was eine Senkung der umweltverbrauchenden Investitionskosten mit sich bringt. Durch den Einsatz von Biosensoren sowie moderner Mess-, Steuer- und Regeltechnik – z. T. auch in Zusammenarbeit mit Prof. Scheper vom TCI der Universit\u00e4t Hannover – sollen diese Hochleistungsverfahren so optimiert werden, dass signifikante Einsparungen von Rohstoffen und Energie im Vergleich zu etablierten Prozessen erzielt werden. Angewandte Gentechnik und moderne MSR-Technik bzw. Biosensorik bilden deshalb den Kern der im Rahmen dieses Projekts eingesetzten Methodenvielfalt.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Im ersten Jahr der Projektlaufzeit wurden die Voraussetzungen f\u00fcr die Entwicklung des neuartigen biotechnologischen Verfahrens zur Phytaseproduktion erarbeitet. An der Universit\u00e4t Bielefeld wurden die folgenden Ergebnisse erzielt. Das Phytasegen wurde mittels PCR aus dem urspr\u00fcnglichen zur Erstklonierung verwendeten Plasmid amplifiziert und in Vektoren hoher Kopienzahl hinter verschiedene Promotoren kloniert. F\u00fcr die Entwicklung eines \u00f6konomischen und ressourcensparenden Produktionsverfah-rens ist es notwendig, dass die Phytase nach \u00dcberexpression in das Kulturmedium sekretiert wird. Um zu untersuchen, ob – \u00e4hnlich wie andere bereits erfolgreich untersuchte Proteine – die Phytase sekretiert wird, sind zwei Varianten verfolgt worden: 1. Stabile Integration der Kassette ins Bakterienchromosom und Lokalisierung des Phytasegens auf einem Multi-copy-Plasmid und 2. Lokalisierung der Kassette auf dem Multi-copy-Plasmid, welches das Phytasegen enth\u00e4lt. F\u00fcr die Integration der Kassette ins Chromosom wurde ein genetisches Verfahren entwickelt, bei dem die Kassette spezifisch in das lacZ-Gen von E. coli integriert wurde. Der Vergleich der beiden o. g. Varianten hinsichtlich der Expression und Sekretion zeigte, dass bei einem Einbau der Kassette in das Expressionsplasmid die Sekretion ins Medium wesentlich h\u00f6her war als bei Integration der Kassette ins Chromosom. Die Sekretion der Phytase ins Medium f\u00fchrte zu einer etwa 6-fachen Steigerung der Gesamtexpression der Phytase, wobei der Anteil des produzierten Enzyms im Medium in Abh\u00e4ngigkeit vom Promotor und der Zusammensetzung des Mediums 70-95% betrug.
\nBei Untersuchungen zum Einfluss des Bakterienstamms auf die Expression und Sekretion erwies sich der Stamm BL21(DE3) als deutlich produktiver als andere St\u00e4mme (TG1, JM109, N4830, E2638). Deshalb wurde dieser Stamm f\u00fcr die weitere Entwicklung des Projekts ausgew\u00e4hlt. Die mit Abstand h\u00f6chste Expression wurde mit dem Tac- und Bgl-Promotor erzielt. Da der Tac-Promotor gegen\u00fcber dem Bgl-Promotor mit zwei wesentlichen Nachteilen behaftet ist (Induktion mit teurem IPTG und Sekretion nur in Komplexmedien) wurde der Bgl-Promotor f\u00fcr die Expression der Phytase verwendet. Das Bakterienwachstum sowie die Expression und Sekretion wurden zun\u00e4chst in Sch\u00fcttelkolbenversuchen in Abh\u00e4ngigkeit von der Kulturdauer untersucht. Dabei konnte gezeigt werden, dass die Phytaseexpression erst in der sp\u00e4ten exponentiellen Wachstumsphase der Bakterien mit bzw. durch den Beginn der Sekretion stimuliert wurde. Der \u00fcberwiegende Teil der gebildeten Phytase konnte im Kulturmedium nachgewiesen werden. Das Bakterienwachstum wurde durch die Bildung der Phytase nicht verz\u00f6gert. Von der ASA Spezialenzyme GmbH wurden Vorversuche zur \u00dcbertragung des Prozesses in den industriellen Ma\u00dfstab durchgef\u00fchrt sowie Marktuntersuchungen vorgenommen. Die Einsatzbereiche f\u00fcr das Enzym Phytase sind die Schweine-, Gefl\u00fcgel- und Fischzucht sowie die Lebensmittelproduktion. Im Bereich der Le-bensmittelproduktion ist die Entwicklung der Akzeptanz der Verbraucher in Europa f\u00fcr Lebensmittel, die unter Verwendung gentechnisch ver\u00e4nderter Hilfsstoffe produziert werden, ebenfalls nur sehr schwer kalkulierbar. F\u00fcr die Absch\u00e4tzung eines Marktpotenzials wurden daher vorerst nur die Daten f\u00fcr die Schweine- und Gefl\u00fcgelzucht verwendet. In Deutschland ergibt sich ein Futtermittelverbrauch von ca. 20 Mio. t Schweinefutter pro Jahr, in Europa von ca. 135 Mio. t. F\u00fcr die Gefl\u00fcgelzucht ergeben sich Werte von 3,2 bzw. 21 Mio. t pro Jahr. Bei einer Einsatzmenge von 500 U Phytase pro kg Futter und einer Akti-vit\u00e4t von 2 Mill. U pro Liter Phytase ergibt sich ein maximales theoretisches Marktpotenzial f\u00fcr Phytase in Deutschland von 5,8 x 106 Liter und in Europa von 39 x 106 Liter. Erste Versuche zur Entwicklung des Aufarbeitungsverfahrens ergaben, dass auf ein Aufschlussverfahren verzichtet werden kann, da das Enzym Phytase nahezu vollst\u00e4ndig in das Medium ausgeschieden wird. Versuche zur Ultrafiltration zeigten, dass die Phytase im Kultur\u00fcberstand aufkonzentriert werden kann.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
1.)\tMiksch, G., Kleist, S. & Flaschel, E. (2000): Fermentative production of a bacterial Phytase. Vortrag auf der Int. Tag. Biotechnology, Berlin.
\n2.)\tMiksch, G., Kleist, S. & Flaschel, E. (2000): Nutzung biotechnologischer Methoden f\u00fcr die Entwicklung von Verfahren zur Produktion einer E. coli-Phytase. Vortrag auf der TerraTec, Leipzig.
\n3.)\tIgbasan et al. (2000): Comparative studies on the in vitro properties of phytases from various microbial origins. Archives of Animal Nutrition, 53: 353-373.
\n4.)\tIgbasan, F.A., Simon, O., Miksch, G., M\u00e4nner, K. (2001): The effectiveness of an Escherichia coli phytase in improving phosphorus and calcium bioavailabilities in poultry and young pigs. Archives of Animal Nutrition, 54: 117-126.
\n5.)\t Miksch, G. & Flaschel, E. (2001): Secretion of homologous and heterologous recombinant proteins in Escherichia coli and other Gramnegative bacteria by using a new secretion system. In: Recombinant Protein Production with Prokaryotic and Eukaryotic Cells. 6.)\t Miksch, G., Kleist, S., Friehs, K., Flaschel, E. & Cordes, A. (2001): Biotechnologische Produktion der E. coli-Phytase. In: Erb, R. & Heiden, S. (Hrsg.) (2001): Sensorik, Sonderausgabe BIOSpektrum: 60-62.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Die im Projekt erzielten Ergebnisse zeigen, dass die \u00dcberexpression der bakteriellen Phytase in E. coli m\u00f6glich ist. Die in E. coli produzierte Phytase kann durch die Nutzung des entwickelten Sekretionssystems in das Kulturmedium sekretiert werden. Damit bestehen die Voraussetzungen f\u00fcr die Entwicklung eines Verfahrens zur extrazellul\u00e4ren Produktion der Phytase. F\u00fcr die Prozessf\u00fchrung, vor allem im Zulauf-Verfahren, ist die Einbeziehung der Sensortechnik notwendig. Erste Fermentationsversuche zeigen, dass eine extrazellul\u00e4re Produktion der bakteriellen Phytase auch im Fermenterma\u00dfstab m\u00f6glich ist.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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