Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Der steigende Bedarf an der Aminos\u00e4ure L-Serin f\u00fcr die Pharma- und Ern\u00e4hrungsmittelindustrie erfordert die Etablierung einer Alternative zur energieaufw\u00e4ndigen und emissionstr\u00e4chtigen klassischen sauren Hydrolyse proteinogener Rohstoffe. Ziel des Projekts ist daher die Entwicklung eines hocheffizienten biotechnologischen Verfahrens zur gezielten Herstellung der Aminos\u00e4ure L-Serin aus Glukose mittels rekombinanter Bakterienst\u00e4mme, bei der lediglich kompostierbare Biomasse als Reststoff neben dem L-Serin anf\u00e4llt. Das herk\u00f6mmliche und das fermentative Verfahren werden dann in neuartiger Weise mittels \u00d6kobilanzierung verglichen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenZiel war die gezielte Entwicklung eines Bakterienstamms, mit dem die Produktion der Aminos\u00e4ure L-Serin m\u00f6glich ist. Durch genetische und molekulare Arbeiten wird die normalerweise gedrosselt ablaufende L-Serin-Synthese in dem Bakterium Corynebacterium glutamicum erh\u00f6ht. Dadurch kommt es zu erh\u00f6hter intrazellul\u00e4rer Synthese von L-Serin und letztlich zu dessen Ausscheidung in das umgebende Medium, aus dem L-Serin isoliert werden kann. Zun\u00e4chst wurden hierzu die verantwortlichen L-Serin-Biosynthesegene aus C. glutamicum isoliert, durch Mutation dereguliert und mittels geeigneter Vektoren in C. glutamicum \u00fcberexprimiert. Des Weiteren wurde der Abbau von L-Serin durch Deletion oder Reduktion der Expression der entsprechenden Gene verhindert. Nach jedem Teilschritt wurde der entsprechende Stamm auf seine F\u00e4higkeit L-Serin ins Medium auszuscheiden getestet. Die besten St\u00e4mme wurden im Laborma\u00dfstab bei der Amino GmbH \u00fcberpr\u00fcft. Parallel erstellte der Lehrstuhl Ordnungs- und Prozesspolitik eine \u00d6kobilanzierung und Wirtschaftlichkeitsanalyse der Referenzprozesse Gewinnung von L-Serin durch Saure Hydrolyse bzw. Fermentation. Dieses beinhaltete folgende Teilschritte: Festlegung von Zieldefinition und Untersuchungsrahmen, Bilanzierung der mit dem L-Serin herstellenden Verfahren verkn\u00fcpften Inputs und Outputs (Sachbilanz), Beurteilung der Sachbilanzergebnisse bez\u00fcg-lich ihrer Umweltwirkungen (Wirkungsbilanz) sowie eine Gesamtbewertung von Sach- und Wirkungsbilanz. F\u00fcr die Erhebung der Basisdaten gab es eine enge Zusammenarbeit mit verschiedenen Abteilungen der Amino GmbH.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Zur gezielten Konstruktion eines L-Serin-Produktionsstamms wurde das Bakterium C. glutamicum verwendet, das bez\u00fcglich seiner F\u00e4higkeit andere Aminos\u00e4uren, wie L-Lysin und L-Glutamat in gro\u00dfen Mengen zu bilden gut untersucht ist. Zun\u00e4chst wurde die L-Serin-Biosynthese untersucht. Die drei verantwortlichen Gene serA, serC und serB wurden aus C. glutamicum kloniert. Die Regulation der L-Serin-Biosynthese erfolgt auf Enzymaktivit\u00e4tsebene durch Hemmung des ersten Enzyms des Biosynthese-wegs, der 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase (PGDH, serA) durch L-Serin. Durch die Konstruktion von mutierten Allelen des serA-Gens von C. glutamicum mittels PCR wurden gezielt PGDH-Muteine erzeugt, die sich nicht mehr durch L-Serin hemmen lassen. Die alleinige \u00dcberexpression des deregulierten serA-Gens f\u00fchrte nicht zu einer gesteigerten L-Serin-Bildung, wie dies z. B. f\u00fcr die L?Lysin-Bildung bekannt ist. Auch die \u00dcberexpression aller drei Biosynthesegene im Wildtyp f\u00fchrte zu keiner signifikanten Steige-rung der L-Serin-Bildung. Dies deutet darauf hin, dass neben der Hemmung auf Aktivit\u00e4tsebene weitere, bisher unbekannte Regulationsmechanismen des L-Serin-Biosynthesewegs vorhanden sind. Neben der L-Serin-Biosynthese wurde auch der Abbau von L-Serin untersucht. L-Serin dient als Vorstufe zur Synthese zahlreicher anderer zellul\u00e4rer Metabolite. Es konnte gezeigt werden, dass vor allem die Umsetzung von L-Serin zu Pyruvat, katalysiert durch das Enzym L-Serin-Dehydratase, sowie die Bildung von Glycin und C1-Kohlenstoffeinheiten aus L-Serin durch das Enzym Serinhydroxymethyltransferase eine gro\u00dfe Bedeutung haben. Das Ausschalten bzw. die Reduktion dieser Reaktionen f\u00fchrte bei gleichzeiti-ger \u00dcberexpression der L-Serin-Biosynthesegene zu einer signifikanten Steigerung der L-Serin-Bildung, jedoch \u00fcberstieg die Ausbeute bezogen auf das eingesetzte Substrat nie 0,05 %. Die L-Serin-Biosynthese erfolgt ausgehend von dem Glykolyseintermediat 3-Phosphoglycerat. Um eine m\u00f6gliche Limitation in der Bereitstellung dieser Vorstufe f\u00fcr die L-Serin-Bildung auszuschalten wurden durch gengerichtete Mutagenese Mutanten hergestellt, die einen Block in der Glykolyse unterhalb der Abzweigung zum L-Serin aufweisen, bzw. Glykolyseintermediate anstauen. Die Kombination dieser Mutationen mit der \u00dcberexpression der L-Serin-Biosynthesegene und einer Reduktion des L-Serin-Abbaus f\u00fchrte letztlich zu einer Steigerung der L-Serin-Ausbeute um das 140-fache, auf bis zu 7,5 % mit einer Produktausbeute von 2,5 g\/l. Als Zielparameter f\u00fcr die industrielle Produktion wurde in der Modellbildung f\u00fcr die \u00d6kobilanz und die Wirtschaftlichkeitsanalyse f\u00fcr das fermentative Verfahren von 30 g\/l Produktausbeute (Anteil des L-Serins im zellfreien Fermentermedium) und 47 % Aufarbeitungsausbeute (Ausbeute im Aufreinigungsverfahren nach der Fermentation) ausgegangen. Unter diesen Rahmenbedingungen zeigen sich signifikante \u00f6kologische Vorteile des neuartigen fermentativen Verfahrens gegen\u00fcber dem etablierten Referenzverfahren der sauren Hydrolyse. Bei fast allen \u00f6kologisch relevanten Input- und Out-putgr\u00f6\u00dfen liegen bei der Fermentation z. T. deutlich g\u00fcnstigere Mengenverh\u00e4ltnisse im Vergleich zur sauren Hydrolyse vor. Insbesondere in den zentralen \u00f6kologischen Bereichen Energiebedarf, Wasserverbrauch und Salzfrachten ist das fermentative Verfahren der sauren Hydrolyse \u00fcberlegen. Aus \u00f6konomischer Sicht bietet die Fermentation bei diesen Zielparametern relativ zur sauren Hydrolyse und unter den Rahmenbedingungen des deutschen Produktionsstandortes zwar Kostenvorteile, um im internationalen Wettbewerb dauerhaft bestehen zu k\u00f6nnen und insbesondere um angesichts des in den letzten Jahren herrschenden Preisdrucks auf dem Markt f\u00fcr Aminos\u00e4uren auch in ung\u00fcnstigen Marktphasen mit ausreichenden Deckungsbeitr\u00e4gen produzieren zu k\u00f6nnen, ist jedoch eine weitere Erh\u00f6hung der Ausbeuten erforderlich. Da die Verbesserung der Aufarbeitungsausbeute nur verfahrenstechnischen Kriterien unterliegt und von der Stammentwicklung unabh\u00e4ngig ist, existiert somit ein zus\u00e4tzliches Optimierungspotenzial des Verfahrens \u00fcber den Kern der Forschungsarbeiten hinaus.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
1.\tPatentanmeldung 100 09 799.5 (25.02.2000): Peters-Wendisch, P. G., Eggeling, L. und Sahm, H.: Nukleotidsequenzen kodierend f\u00fcr Proteine beteiligt an der Biosynthese von L-Serin und Verfahren zu dessen Herstellung.
\n2.\t[Zusatzanmeldung (06.09.2000): Peters-Wendisch, P. G., Simic, P., Eggeling, L. und Sahm, H.: Verbessertes Verfahren zur mikrobiellen Herstellung von L-Serin sowie ein dazu geeigneter gene-tisch ver\u00e4nderter Mikroorganismus]
\n3.\tPatentanmeldung 102 31 297.4 (10.07.2002): Peters-Wendisch, P., Netzer, R., Eggeling, L., Faurie, R., Kla\u00dfen, B., Sahm, H.: Gezielte Deregulation der 3-Phosphoglycerat-Dehydrogenase aus C. glutamicum.
\n4.\tPatentanmeldung (M\u00e4rz 2003): Peters-Wendisch, P., Netzer, R., Eggeling, L., Sahm, H.: Verfahren zur Produktion von L-Serin durch Ausschaltung von L-Serin-Dehydratase Aktivit\u00e4t in Bakterien, am Beispiel Corynebacterium glutamicum.
\n5.\tPeters-Wendisch, P., Eggeling, L., Netzer, R., Sahm, H., Serger, H., M\u00fcller, U., Willke, B. und Faurie, R. (2001): Mikrobielle L-Serinproduktion unter besonderer Ber\u00fccksichtigung der \u00d6kobilanzie-rung. In: Erb, R. & Heiden, S. (Hrsg.) (2001): Biokatalyse, Sonderausgabe BIOSpektrum: 65-69.
\n6.\tFaltblatt f\u00fcr die BioTechnica 2001: Mikrobielle L-Serin-Produktion.
\n7.\tPeters-Wendisch, P., Netzer, R., Eggeling, L., Sahm, H. (2002): 3-Phosphoglycerate dehydrogenase from Corynebacterium glutamicum: the C-terminal domain is not essential for activity but is required for inhibition by L-serine. Appl Microbiol Biotechnol. 60(4):437-441.
\n8.\tPeters-Wendisch, P., Netzer, R., Eggeling, L., Sahm, H.: L-Serine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum. Poster, VAAM-Tagung 2003, Berlin.
\n9.\tNetzer, R., Peters-Wendisch, P., Etterich, H., Eggeling, L., Sahm, H.: The role of L-serine dehydratase for growth and L-serine production of Corynebacterium glutamicum. Vortrag KI001, VAAM-Tagung 2003, Berlin.
\n10.\tNetzer, R., Peters-Wendisch, P., Lange, C., Wendisch, V. F., Eggeling, L.: Role of 3-phosphoglycertate mutase and pyruvate kinase in Corynebacterium glutamicum for growth and L-serine production. Vortrag KD011, VAAM-Tagung 2002, G\u00f6ttingen.
\n11.\tNetzer, R., Peters-Wendisch, P., Lange, C., Wendisch, V. F., Eggeling, L., Sahm, H.: Investigations of the glycolysis and L-serine biosynthesis in Corynebacterium glutamicum Poster VAAM Work-shop: Biologie bakterieller Naturstoffproduzenten Nov. 2001, Berlin. 12.\tDock, Ch. (1999): Isolation von Corynebacterium glutamicum-Mutanten, die keine Feedback-Hemmung der Phosphoglycerat-Dehydrogenase besitzen Studienarbeit der Universit\u00e4t Braunschweig, durchgef\u00fchrt bei der Amino GmbH.
\n13.\tNetzer, R. (in Vorbereitung): Untersuchungen zur Regulation der Glykolyse und zur L-Serinbildung mit Corynebacterium glutamicum. Promotionsarbeit der Universit\u00e4t D\u00fcsseldorf, durchgef\u00fchrt am Institut f\u00fcr Biotechnologie 1 des Forschungszentrums J\u00fclich.
\n14.\tStolz, M. (in Vorbereitung): Einfluss der Serinhydroxymethyltransferase (glyA) auf die Serin-Bildung mit Corynebacterium glutamicum. Diplomarbeit der Fachhochschule Aachen, Abt. J\u00fclich, durchgef\u00fchrt am Institut f\u00fcr Biotechnologie 1 des Forschungszentrums J\u00fclich.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Durch gezieltes Metabolic Engineering des Stoffwechsels von C. glutamicum konnte ein Stamm entwickelt werden, mit dem L-Serin mit einer 0,25 %-igen Produktausbeute produziert werden kann. Damit wurde eine au\u00dferordentliche Steigerung der L-Serin-Bildung gegen\u00fcber der Ausgangssituation erreicht. Es wurde gezeigt, dass am Abbau von L-Serin in vivo ein bisher noch wenig untersuchtes Enzym betei-ligt ist. Dar\u00fcber hinaus sind vermutlich eine Reihe weiterer Reaktionen am Abbau beteiligt, die durch den Ansatz des gezielten Metabolic Engineering nicht erfasst werden k\u00f6nnen. Die Arbeiten haben gezeigt, dass es ein gro\u00dfes Potenzial gibt, L-Serin fermentativ aus Glukose, und damit umwelt- und ressourcenschonend zu produzieren, dass es jedoch eine Vielzahl bisher unbekannter Faktoren in der Zelle gibt, die die L-Serin-Bildung beeinflussen. Die bisherige Produktivit\u00e4t reicht noch nicht aus, um L-Serin wirtschaftlich zu produzieren. Aufgrund des Wissens, das in diesem Projekt erarbeitet wurde, ist es nun m\u00f6glich in zuk\u00fcnftigen Arbeiten die erforderlichen Hochleistungsprodukti-onsst\u00e4mme zu gewinnen. Durch die Realisierung dieses Ziels kann in Zukunft L-Serin auf \u00f6kologisch wesentlich vertr\u00e4glichere Weise und unter Gew\u00e4hrleistung der internationalen Wettbewerbsf\u00e4higkeit des beteiligten mittelst\u00e4ndischen Produzenten hergestellt werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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