Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Als unges\u00e4ttigter kurzkettiger Kohlenwasserstoff ist Isopren ein begehrter Rohstoff der Kunststoff- und Kautschukindustrie. Es ist nur zu sehr geringem Anteil im Erd\u00f6l enthalten und wird derzeit aufwendig aus dem C5-Schnitt der Raffinerien hergestellt. Ziel des geplanten Projekts ist, die Gene f\u00fcr die Isoprensynthese aus Laubb\u00e4umen und Cyanobakterien zu isolieren und in Bakterien zu exprimieren, um \u00fcber die Expression der eingebrachten Isoprensynthesegene zu einer kosteng\u00fcnstigen, ressourcenschonenden biotechnologischen Produktion dieser Verbindung im Gro\u00dffermenter zu gelangen.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenF\u00fcr die Isolierung des Isoprensynthesegens wurde in dem Projekt zus\u00e4tzlich zu den bereits im Labor vorhandenen cDNA-lambda-Genbanken der Isopren produzierenden Stieleiche (Quercus robur L.) und der Hybridpappel (Populus alba x P. tremula) eine genomische Genbank aus dem ebenfalls Isopren produzierenden Cyanobakterium Anacystis nidulans in Cosmiden erstellt. In der Cyanobakterien-Cosmid-Genbank konnten die Gene der Eingangsenzyme (dxs, dxr) der Isoprenoidsynthese nach Amplifikation eines Segments mittels PCR \u00fcber DNA-Hybridisierung identifiziert und isoliert werden. Durch deren Klonierung und anschlie\u00dfender Expression wurde ein E.coli-Stamm konstruiert, in dem die Konzentration der Vorstufe (DMADP) 7-fach gegen\u00fcber dem Wildstamm erh\u00f6ht war. Auf der Basis eines aus cDNA eines Hybridpappelblatts erhaltenen PCR-Segments konnte das komplette Gen in der lambda-cDNA-Bank der Pappel \u00fcber Hybridisierung identifiziert werden. Nach Klonierung und Expression des Gens in den DMADP \u00fcberproduzierenden E.coli-Stamm wurde ein Klon isoliert, der gegen\u00fcber dem Wildtyp 400 mal mehr Isopren in den Gasraum der Kultur freisetzt und der sich so f\u00fcr die Entwicklung eines biotechnologischen Isoprenproduktionsverfahrens eignet.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Mit dem Ziel, die Bildungsrate der Vorstufen der Isoprenoidsynthese in dem f\u00fcr die geplante biotechnologische Isoprenproduktion geeigneten Bakterienstamm zu erh\u00f6hen, wurde im Rahmen des Projekts eine Cosmid-Genbank aus dem Cyanobakterium Synechococcus leopoliensis erstellt. Mittels PCR konnte mit spezifischen Oligonukleotidprimern f\u00fcr die Gene der Eingangsenzyme der Isoprenoidbiosynthese (dxs, dxr) jeweils ein Segment dieser Gene amplifiziert werden. Mit Hilfe dieser Amplifikate wurde jeweils ein Cosmid der Genbank identifiziert, das das dxs-Gen bzw. das dxr-Gen als Bestandteil eines Operons trug. Die beiden Gene wurden jeweils hinter einen bakteriellen Promotor kloniert, und nach Expression in E.coli wurde in einem Funktionstest die Identit\u00e4t der Genprodukte eindeutig als die gesuchten Eingangsenzyme des Isoprenoidstoffwechsels nachgewiesen. \u00dcber das Einbringen des dxs-enthaltenden Plasmids konnte ein E.coli-Stamm bereitgestellt werden, der gegen\u00fcber dem Wildstamm eine 8-fach erh\u00f6hte Konzentration der Isopren-Vorstufe Dimethylallyldiphosphat besitzt. Einbringen des dxr-enthaltenden Plasmids f\u00fchrte zu keiner signifikanten Steigerung der Dimethylallyldiphosphatbildung. Um schlie\u00dflich zu einem biotechnologisch verwertbaren Stamm zu gelangen, der auch das letzte Enzym in der Kette zur Isoprenbildung, die Isoprensynthase, enth\u00e4lt und damit bei seiner Anzucht gro\u00dfe Mengen Isopren freisetzt, wurden eine Reihe von PCR-Experimenten mit cDNA der Hybridpappel unter Verwendung von abgeleiteten Primern von ansequenzierten Peptidfragmenten der Isoprensynthase durchgef\u00fchrt. Auf dieser Basis gelang erstmalig die Amplifizierung eines Segments des Isoprensynthasegens. \u00dcber Hybridisierung konnte in der lambda-cDNA-Bank der Pappel ein Phage identifiziert werden, der das gesamte Gen der Isoprensynthase trug. Die Sequenzierung ergab, da\u00df dieses Gen gro\u00dfe \u00c4hnlichkeit zu Monoterpensynthasen besa\u00df und da\u00df am 5-Ende eine f\u00fcr ein Signalpeptid kodierende Region vorhanden ist. Diese Region wurde entfernt und das verbleibende Gen hinter einen bakteriellen Promotor kloniert. Nach Expression des Gens zeigte das Genprodukt im Funktionstest wie erwartet eine deutliche Isoprensynthaseaktivit\u00e4t. Die Klonierung des Gens in den Stamm, der bereits das cyanobakterielle dxs-Gen exprimierte, f\u00fchrte zu einem Bakterienstamm, der gegen\u00fcber der rein chemischen Isoprenfreisetzung des Wildstamms ca. 400 mal mehr Isopren in den Gasraum der Kultur freisetzt und sich damit f\u00fcr eine biotechnologische Isoprenproduktion eignet.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Teile der Arbeit wurden publiziert unter:Miller B., Heuser T., Zimmer W. (1999) FEBS Letters 460: 485-490Miller B., Heuser T., Zimmer W. (2000) FEBS Letters 481: 221-226Miller B., Oschinski C., Zimmer W. (2001) Planta (angenommen)<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Das Projekt erzielte das gew\u00fcnschte Ergebnis.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
Zielsetzung und Anlass des Vorhabens Als unges\u00e4ttigter kurzkettiger Kohlenwasserstoff ist Isopren ein begehrter Rohstoff der Kunststoff- und Kautschukindustrie. Es ist nur zu sehr geringem Anteil im Erd\u00f6l enthalten und wird derzeit aufwendig aus dem C5-Schnitt der Raffinerien hergestellt. Ziel des geplanten Projekts ist, die Gene f\u00fcr die Isoprensynthese aus Laubb\u00e4umen und Cyanobakterien zu isolieren und […]<\/p>\n","protected":false},"author":1,"featured_media":0,"template":"","meta":{"footnotes":""},"categories":[],"tags":[57,47,52,53],"class_list":["post-20919","projektdatenbank","type-projektdatenbank","status-publish","hentry","tag-bayern","tag-klimaschutz","tag-umweltforschung","tag-umwelttechnik"],"meta_box":{"dbu_projektdatenbank_az_ges":"13030\/01","dbu_projektdatenbank_medien":"","dbu_projektdatenbank_pdfdatei":"A-13030.pdf","dbu_projektdatenbank_bsumme":"102.258,38","dbu_projektdatenbank_firma":"Fraunhofer-Institut f\u00fcr Atmosph\u00e4rischeUmweltforschung (IFU)","dbu_projektdatenbank_strasse":"Kreuzeckbahnstr. 19","dbu_projektdatenbank_plz_str":"82467","dbu_projektdatenbank_ort_str":"Garmisch-Partenkirchen","dbu_projektdatenbank_p_von":"1999-02-01 00:00:00","dbu_projektdatenbank_p_bis":"2002-01-14 00:00:00","dbu_projektdatenbank_laufzeit":"2 Jahre und 11 Monate","dbu_projektdatenbank_telefon":"08821\/183-121","dbu_projektdatenbank_inet":"","dbu_projektdatenbank_bundesland":"Bayern","dbu_projektdatenbank_foerderber":"12","dbu_projektdatenbank_ab_bericht":"","dbu_projektdatenbank_ist_nachbewilligung_von":"","dbu_projektdatenbank_hat_nachbewilligung":"","dbu_headerimage_cover":"","dbu_submenu":"","dbu_submenu_position":"","dbu_submenu_entry":[]},"_links":{"self":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/20919","targetHints":{"allow":["GET"]}}],"collection":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank"}],"about":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/types\/projektdatenbank"}],"author":[{"embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/users\/1"}],"version-history":[{"count":1,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/20919\/revisions"}],"predecessor-version":[{"id":33922,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/projektdatenbank\/20919\/revisions\/33922"}],"wp:attachment":[{"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/media?parent=20919"}],"wp:term":[{"taxonomy":"category","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/categories?post=20919"},{"taxonomy":"post_tag","embeddable":true,"href":"https:\/\/www.dbu.de\/en\/wp-json\/wp\/v2\/tags?post=20919"}],"curies":[{"name":"wp","href":"https:\/\/api.w.org\/{rel}","templated":true}]}}