Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Cyclosporin A (CsA) stellt heutzutage das Medikament erster Wahl zur therapeutisch induzierten Immunsuppression in der Transplantationsmedizin dar. Der Einsatz von CsA bedarf jedoch einer strengen Kontrolle, da das therapeutische Fenster der Dosierung relativ schmal ist. Um die Aussagekraft der CsA-Analytik zu verbessern, wird heute diskutiert, im Gegensatz zur Bestimmung der Pharmakokinetik die Pharmakodynamik eines Medikamentes zu bestimmen. Durch die ver\u00e4nderte Analytik soll eine Optimierung der Dosierung des Medikamentes erleichtert werden. Ziel dieses Projektes war die Verbesserung der medizinischen Betreuung von Transplantationspatienten durch Entwicklung einer wirkungsbezogenen und umweltfreundlichen Analysenmethode f\u00fcr CsA. Mit dem zu entwickelnden Rezeptorassay, bei dem eine Bindung von CsA-Metaboliten an die physiologischen Rezeptorproteine (Calcineurin, Cyclophilin A) und damit eine vorhandene immunsuppressive Wirkung von CsA-Metaboliten miterfa\u00dft wird, wurde die M\u00f6glichkeit der Bestimmung der biologischen Aktivit\u00e4t des Medikamentes CsA aufgegriffen. Durch Nachweis und Quantifizierung der Ausbildung des tern\u00e4ren in vivo-Wirkkomplexes aus Calcineurin, Cyclophilin A und CsA bzw. CsA-Metaboliten im Gemisch soll ein Wert f\u00fcr die immunsuppressive Aktivit\u00e4t einer Probe bestimmt werden. Entsprechend der Forderung des Ausschreibungstextes des Schwerpunktes Biomedizintechnik kann durch die innovative Bestimmung der Wirkung des Medikamentes aus dem Blut eines Patienten die Funktionsf\u00e4higkeit implantierter Transplantate \u00fcberwacht, gesch\u00fctzt und die intensivmedizinische Betreuung des Patienten erleichtert werden. Zudem kommt die neue Analytik nahezu ohne die Verwendung von organischen L\u00f6sungsmitteln aus, so da\u00df sie im Bereich Ressourcenschonung und Umweltschutz der bisher in vielen F\u00e4llen unersetzlichen HPLC-Analytik deutlich \u00fcberlegen ist.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Vorbereitung der Blutproben wurde f\u00fcr die Biacore-Analysenmethode optimiert, die Verwendung von organischen L\u00f6sungsmitteln soweit wie m\u00f6glich minimiert. Die Messung selbst erfolgt grunds\u00e4tzlich im w\u00e4\u00dfrigen Puffersystem, so da\u00df die gro\u00dfe Menge an organisch-w\u00e4\u00dfrigem Abfall, die bei der HPLC anf\u00e4llt, vermieden wird. Die mit der Biacore-Methode f\u00fcr verschiedene Metabolite bestimmte immunsuppressive Wirkung wurde mit Literaturwerten aus Zellkulturexperimenten verglichen. Um die Aussagekraft der Methode bei der Analyse von Blutproben abzusichern, wurden Patientenproben in der Zeit nach der Transplantation mit den drei Analysensystemen (HPLC, TDx, Biacore) vermessen. Durch die Zusammenarbeit von Inventus BioTec mit dem Labor der Uniklinik M\u00fcnster ergab sich bei der \u00fcblichen intensivmedizinischen Betreuung von Organempf\u00e4ngern die M\u00f6glichkeit, viele klinische Daten \u00fcber die transplantierten Patienten zu erhalten. Somit sind etwaige Einflu\u00dfgr\u00f6\u00dfen und St\u00f6rfaktoren auf den zu entwickelnden Test in der pr\u00e4analytischen Phase gut zu untersuchen. So konnte f\u00fcr einige medizinische Parameter die \u00dcberlegenheit der Biacore-Analytik gegen\u00fcber bisherigen Methoden bewiesen werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die Methode der Festphasenextraktion von CsA ist f\u00fcr die Bestimmung mit dem Biacore optimiert worden. Dabei wurde f\u00fcr CsA eine Wiederfindungsrate von 74,1 \u00b1 3,9 % nachgewiesen; die Pr\u00e4zision des Me\u00dfger\u00e4tes selbst liegt bei Vermessung eines Standards bei 0,7% und eines Extraktes bei 0,9%. Bei der Extraktion konnte auf die Verwendung von Acetonitril verzichtet werden. Da die Messung mit dem Biacore selbst g\u00e4nzlich ohne den Einsatz organischer L\u00f6sungsmittel auskommt, bleibt bei Einsatz der Methode in der Routineanalytik anstelle der HPLC die im Antrag beschriebene Einsparung von 3.960 Litern hochreinem Acetonitril bzw. von 6.930 Litern zu entsorgendem Acetonitril\/Wasser-Gemisch pro Jahr bestehen. Die Untersuchung der Komplexbildung von verschiedenen CsA-Derivaten, CsA-Metaboliten, k\u00fcnstlichen Derivaten und nat\u00fcrlichen Cyclosporinen mit dem Biacore ergab sehr unterschiedliche F\u00e4higkeiten der verschiedenen Substanzen, den tern\u00e4ren Wirkkomplex auf dem Sensorchip auszubilden. Dem gegen\u00fcbergestellt wurden die von verschiedenen Autoren in unterschiedlichen Zellkulturexperimenten ermittelten immunsuppressiven Wirkungen der entsprechenden Substanzen. Es stellte sich heraus, da\u00df die mit dem Biacore ermittelte Komplexbildungsaktivit\u00e4t gut mit den Ergebnissen der Zellkulturen korreliert. Ein Vergleich der Me\u00dfergebnisse der untersuchten Analysensysteme f\u00fcr die Bestimmung von CsA im Blut ergab eine Korrelation zwischen Biacore und TDx von 0,567 (n = 194) und zwischen Biacore und HPLC von 0,574 (n = 151). Die mit dem Biacore ermittelten CsA-Werte sind im Durchschnitt um 20% gr\u00f6\u00dfer als die TDx-Werte und im Durchschnitt um 40% gr\u00f6\u00dfer als die HPLC-Werte. Da mit der HPLC-Methode die reine CsA-Konzentration bestimmt wird, hat die Anwesenheit von Metaboliten offensichtlich einen recht gro\u00dfen Einflu\u00df auf die Biacore-Bestimmung. Die Korrelation der Ergebnisse der verschiedenen Methoden mit klinischen relevanten Daten der Patienten ergab eine gute negative Korrelation der mit dem Biacore gemessenen CsA-\u00c4quivalent-Werte und der absoluten Zahl an Leukozyten, B-Lymphozyten und cytotoxischen T-Zellen sowie eine gute Korrelation zu dem prozentualen Wert der Monozyten-, Basophilen- und T-Lymphozytenzahl. Die Ergebnisse der TDx- sowie der HPLC-Methode zeigen eine im Vergleich zur Biacore-Methode schlechtere Korrelation auf. Eine signifikante Korrelation zwischen den Ergebnissen der mit dem Biacore gemessenen CsA-\u00c4quivalent-Werten und der Konzentration der Zellen des Immunsystems beweist folglich einen direkten Zusammenhang zwischen dem Me\u00dfwert f\u00fcr die Aktivit\u00e4t von CsA und seinen Metaboliten und der Immunsuppression des Patienten. Die Werte der Klinischen Chemie zeigen weiterhin eine signifikante Korrelation zwischen der Biacore-Methode mit den Blutwerten Cholesterin, Bilirubin und Alkalischer Phosphatase. Die beiden letztgenannten Blutwerte werden zur Kontrolle der Leberfunktion des Patienten herangezogen, so da\u00df eine positive Korrelation mit den gemessenen CsA-\u00c4quivalent-Werten auf einen Zusammenhang zwischen erh\u00f6hten CsA- bzw. CsA-Metabolit-Werten und verschlechterter Leberfunktion des Patienten hinweist. Es ist bekannt, da\u00df besonders CsA-Metabolite f\u00fcr die toxische Wirkung des Medikamentes verantwortlich sind. Eine signifikante Korrelation mit Cholesterin ist von besonderem Interesse, da einige Studien diesen Parameter als Prognosefaktor bei schwer erkrankten Patienten ermittelt haben. Weiterhin zeigen Untersuchungen, da\u00df niedrige Konzentrationen von Cholesterin in Verbindung mit erh\u00f6hten CsA-Metaboliten h\u00e4ufig zu neurologischen Symptomen f\u00fchren. Diese Nebenwirkungen sind f\u00fcr eine deutliche Verschlechterung bei der Pflege und der Dauer des Krankenaufenthaltes verantwortlich.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
\u00b7\tProtection of Organ Transplants by Control of the Immunosuppressive Activity of Cyclosporin A, pr\u00e4sentiert auf der DECHEMA-Tagung 1999 in Wiesbaden und publiziert im Tagungsband
\n\u00b7\tInnovative Receptor Assay for the Determination of the Immunosuppressive Activity of Cyclosporin A, pr\u00e4sentiert auf dem 10. Heiligenst\u00e4dter Kolloquium 2000 und und publiziert im Tagungsband sowie pr\u00e4sentiert auf dem BioGenTec-Forum NRW-2001
\n\u00b7\tInnovative Receptor Assay for the Determination of the Immunosuppressive Activity of the Drug Cyclosporin A and Its Metabolites, vorgetragen auf dem Workshop Toxicity sensors in Hannover, 2001 und auf dem BioGenTec-Forum NRW-2001 in K\u00f6ln
\n\u00b7\tBeate Vollenbr\u00f6ker, Manfred Fobker, Bernfried Specht, Norbert Bartetzko, Michael Erren, Friedrich Spener und Helge Hohage. Receptor Assay Based on Surface Plasmon Resonance for the Assessment of the Immunosuppressive Activity of Cyclosporin A and Its Metabolites. Analytical Biochemistry, eingereichtEine Publikation, in der klinische Daten pr\u00e4sentiert werden sollen, ist in Vorbereitung und soll in dem Journal Transplantation ver\u00f6ffentlicht werden<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Zusammengefa\u00dft l\u00e4\u00dft sich f\u00fcr die untersuchten Blutproben von Transplantationspatienten sagen, da\u00df mit dem Biacore der Status der Immunsuppression von Patienten am besten bestimmt wird. Weiterhin ist eine verbesserte Korrelation mit der Leberfunktion der Patienten im Vergleich zum TDx zu verzeichnen. Die Korrelationen der Ergebnisse der HPLC mit den Werten, die die Immunsuppression und das Auftreten von Nebenwirkungen widerspiegeln, sind deutlich schlechter, da mit der HPLC-Methode das Auftreten der Metabolite nicht quantifiziert wird. Die Ergebnisse entsprechen den Erwartungen und unterst\u00fctzen die Vermutung, da\u00df durch Bestimmung der CsA-Aktivit\u00e4t mit Hilfe des in vivo-Wirkkomplexes die CsA-Analytik erheblich verbessert wird. Im Rahmen des Statusseminars in Frankfurt am 23.-24. April 2001 wurde vom Gutachter angeregt, die Arbeiten auf diesem Gebiet fortzuf\u00fchren. Die Projektpartner beabsichtigen auch, die Zusammenarbeit auf diesem Gebiet fortzusetzen.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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