Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Um vom Schimmelpilz Fusarium – verantwortlich f\u00fcr die Bildung von Mykotoxinen und das Ph\u00e4nomen des Gushing (deutsch: Wildwerden) von Bier – befallenes Getreide in M\u00e4lzereien oder Brauereien rasch zu erkennen und auszuschleusen, wird ein Me\u00dfverfahren auf Basis der Turbidometrischen Flie\u00dfinjektions-Immunoanalyse (TIA) entwickelt. Im Feldversuch eines Brauerei-Laboratoriums soll durch Gegen\u00fcberstellung mit bisher angewandten Methoden gezeigt werden, dass das Me\u00dfverfahren einen erheblichen Zeitvorteil besitzt und sich als zuverl\u00e4ssigerer Pr\u00e4indikator f\u00fcr Fusarien-Kontaminationen eignet. Ziel ist es, dem Markt eine Messger\u00e4tel\u00f6sung zur Verf\u00fcgung zu stellen, welche das Einbringen belasteten Rohmaterials in die Produktion von M\u00e4lzereien bzw. Brauereien schon in der Wareneingangs- und Qualit\u00e4tskontrolle verhindert, somit zu Verbraucherschutz und Ressourcenschonung (Energie, Wasser, Rohstoffe) beitr\u00e4gt und zudem Modellcharakter f\u00fcr weitere Anwendungen z.B. Lebensmittelindustrie aufweist.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenNach der Definitionsphase (ca. 2 Monate) sorgte die M\u00e4rkische Fachhochschule (MFH) Iserlohn in der Anfangsphase (ca. 11 Monate) f\u00fcr den Aufbau des Latex-Agglutinationstests ( LAT ) zur Bestimmung fusariengattungsspezifischer, extrazellul\u00e4rer Polysaccharide (EPS). Die Validierung (Nachweis der Korrelation zwischen Fusarien-Befall und EPS-Gehalt) des von Hand durchgef\u00fchrten Tests erfolgte zun\u00e4chst mittels kultureller Untersuchungen anhand von Realproben. Auch eine nicht kontaminierte Gersten-Probe wurde aus Spanien beschafft und im Labor probeweise kontaminiert zur vergleichenden Validierung des Nachweises mittels EPS-LAT und PCR. Auch der zeitliche Verlauf der Kontamination wurde so verfolgt.
\nAnschlie\u00dfend wurde der Latex-Agglutinationstest an die Flie\u00dfinjektionsanalyse adaptiert (turbidometrische Flie\u00dfinjektions-Immunoanalyse – TIA). Als Ger\u00e4tebasis zur Realisierung dieses TIA-Verfahrens wurde ein modulares Flie\u00dfanalyse-(FIA-)System aufgebaut und als fertiges Laboranalyseger\u00e4t konfektioniert, das die automatische Abarbeitung von Proben, die Datenerfassung und -auswertung erm\u00f6glicht.
\nDie Adaption des Latex-Agglutinationstests zur Bestimmung von Fusarium-EPS auf die FIA, die Optimierung des Verfahrens und
\nValidierung des Messger\u00e4ts wurde in enger Abstimmung zwischen der J\u00dcKE Systemtechnik GmbH und der MFH Iserlohn durchgef\u00fchrt.
\nDie Validierung, bei der die Korrelation zwischen Fusarium-EPS und Fusarien-Befall nachzuweisen ist, erfolgte mittels kultureller Methoden, welche von der MFH Iserlohn durchgef\u00fchrt wurden, sowie eines PCR-Verfahrens (nach: M.L. Niessen, R.S. Vogel, Group Specific PCR – Detection of potential Trichothecene producing Fusarium species in Pure Cultures and Cereal Samples, System. Appl. Microbiol. 21 (1998), 618-631). Die Entwicklung der PCR-Methode und Durchf\u00fchrung der Untersuchungen mit der PCR wurden bei der Lebensmittellabor Dr. We\u00dfling GmbH in Altenberge in Auftrag gegeben.Nach dem Redesign, in welcher Optimierungen im Hinblick auf einen zuverl\u00e4ssigen Serienstand erfolgen sollte, sollte das Messger\u00e4t schlie\u00dflich im Feldversuch eines M\u00e4lzerei- bzw. Brauerei-Laboratoriums erprobt werden. Dort sollte es bisher angewandten Methoden wie kulturellen Untersuchungen und der manuellen Auslese roter K\u00f6rner (Handbonitierung), welche zu lange Analysenzeiten oder unzureichende Korrelationen zu Mykotoxingehalt oder Gushing-Neigung aufweisen, alternativ gegen\u00fcber gestellt werden.<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
Die mehrfach \u00f6ffentlich vorgestellten Ergebnisse zeigen eine deutliche Korrelation zwischen dem Grad an Fusarium – Kontamination und der Reaktion im EPS-LAT einerseits und dem PCR gest\u00fctzten Nachweis andererseits. Der von Hand durchgef\u00fchrte Test eignet sich daher sehr gut f\u00fcr ein schnelles Screening. Der Versuch der Automatisierung durch Nutzung eines Photometers ergab zwar interpretierbare Ergebnisse in Bezug auf Kontamination, zeigt aber eine Schwachstelle beim notwendigen, zwischengeschalteten Zentrifugationsschritt auf. Dieser erfordert Fingerspitzengef\u00fchl, denn je nach Art des Abzugs des \u00dcberstands zur Photometrie kann man unterschiedliche Tr\u00fcbungen erhalten, die nur Falschwerten entspr\u00e4chen. Ein Ansatz zur L\u00f6sung des Problems mit dem Zentrifugationsschritt wurde in der Filtration gesehen. Doch Vorversuche ergaben stets eine fast komplette Adsorption \/ Filterung der Latex-Antik\u00f6rper, so dass das Filtrat stets die gleich Extinktion \/ Tr\u00fcbung aufwies, unabh\u00e4ngig vom zugegebenen EPS-Gehalt. Die Suche nach anderen Filtern blieb erfolglos.
\nZur Vermeidung des Zentrifugationsschritts wurde der Testansatz nach Herstellung per Hand direkt in die FIA injiziert und die Tr\u00fcbung vermessen. Da die Tr\u00fcbungsunterschiede der einzelnen Proben zu gering ausfallen, kann diese Direktmessung nicht weiter genutzt werden. An den erhaltenen Ergebnissen war deutlich zu erkennen, dass trotz ausreichender Signalausbeute kein erkennbarer Unterschied zwischen EPS-Standards unterschiedlicher Konzentrationen besteht (dies konnte in mehreren Versuchsreihen mit unterschiedlichen Methoden und verschiedenen Konzentrationen bewiesen werden). Zu diesem Zeitpunkt wird daher davon ausgegangen, dass der EPS-Test in der FIA nicht kalibrierbar und eine Automatisierung des Tests nicht m\u00f6glich ist. Im Handling der L\u00f6sungen ergab sich zudem die Problematik einer st\u00f6renden Sedimentation des Latex-Agglutinationsreagenz.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
Neben den T\u00e4tigkeiten, die von der Koordinationsstelle des Verbunds Sensorik in der Biotechnologie ausge\u00fcbt werden (z.B. Pr\u00e4sentation der Einzelprojekte im Internet, Pr\u00e4sentation des Verbundes auf der BIOTECHNICA 99), wurden bisher folgende Ver\u00f6ffentlichungen und Pr\u00e4sentationen verwirklicht:
\n–\tPosterpr\u00e4sentation w\u00e4hrend der DECHEMA-Jahrestagung vom 27.-29.04.99 in Wiesbaden
\n–\tBeitrag in der Chemischen Rundschau vom 07.01.00
\n–\tPosterpr\u00e4sentation GVC-Tagung Proze\u00dfme\u00dftechnik in der Biotechnologie v. 08.-09.05.00 in Bamberg
\n–\tVortrag am 24.05.00 w\u00e4hrend der 26. Ausstellungstagung Internationales Treffen f\u00fcr chem. Technik, Umweltschutz und Biotechnologie (ACHEMA 2000) in Frankfurt
\n–\tPosterpr\u00e4sentation beim 10. Heiligenst\u00e4dter Kolloquium Technische Systeme f\u00fcr die Biotechnologie und Umwelt (09.-11.10.00)
\n–\tVortrag auf dem Toxicity Workshop im ITC der Uni Hannover ( 5.2.2001)
\n–\tVortrag und Posterpr\u00e4sentation auf dem BioGenTec-Forum in K\u00f6ln ( 28.2. – 1.3.2001 )
\n–\tPoster auf der 19. DECHEMA Jahrestagung der Biotechnologen in Leipzig ( 13. – 15.4.2001 )
\n–\tPoster auf der BIOSENSOR 2001 in T\u00fcbingen ( 1. – 3.4.2001 )<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Aufgrund der unzureichenden Ergebnisse bei dem Versuch, den EPS-Test an die FIA zu adaptieren, wurde es als nicht sinnvoll bewertet, Meilensteine 5 und 6 (Redesign und Feldtest) in Angriff zu nehmen. Das Projektvorhaben wurde daher an dieser Stelle abgebrochen. Es erscheint nicht sinnvoll, die bisher entwickelten Methoden weiter zu verfolgen, wenn die Absicht besteht, den Test in eine automatisierte Form zu \u00fcberf\u00fchren. \u00dcber die M\u00f6glichkeit, mit modernen rechnergest\u00fctzten Bildverarbeitungsmethoden den einfachen EPS Test zu adaptieren, soll an anderer Stelle diskutiert werden.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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