Zielsetzung und Anlass des Vorhabens<\/p>\n
Bei der biotechnologischen Herstellung (Batch-Biotransformationsprozess) reiner L-Aminos\u00e4uren\/ a-Ketos\u00e4uren mittels D-Aminos\u00e4ureoxidase (D-AO; intrazellul\u00e4r immobilisiert) stehen momentan noch keine ausreichend sensitiven und selektiven Analysemethoden f\u00fcr die Prozesskontrolle zur Verf\u00fcgung. Problematisch ist das bei Oxidationsprozessen \u00e4quimolar zum Substrat entstehende Wasserstoffperoxid (H2O2), das den Biokatalysator denaturiert, eine Nebenproduktbildung verursacht und somit die a-Ketos\u00e4ureausbeute signifikant verringert. Ziel dieses Projekts war die Verfahrensoptimierung durch eine automatische, sensorgesteuerte Zugabe von Katalase, um die durch das Peroxid resultierenden Probleme zu beheben.<\/p>\n
Darstellung der Arbeitsschritte und der angewandten MethodenDie Prozessoptimierung sollte in drei ineinander \u00fcbergehenden Projektabschnitten realisiert werden. Im ersten Projektabschnitt wurde die angestrebte Automatisierung durch den Einsatz einer online Flie\u00dfinjektionsanalyse (FIA) mit Enzymsensor verfolgt. Hierzu erfolgte ein Screening nach geeigneten Peroxidasen und Untersuchungen zur Herstellung von Peroxidase-Immobilisaten zur sensitiven, spektralphotometrischen Detektion von H2O2 mit geeigneten Chromogenen (9 Monate).
\nEs folgten Biotransformationen mit unterschiedlichen Substraten und verschiedenen Biokatalysatorformen ohne und mit externer Katalasezugabe. Verschiedene kommerziell erh\u00e4ltliche Katalasen wurden hinsichtlich ihrer eigenen Prozessstabilit\u00e4t, der Kinetik des H2O2-Abbaus, der a-Ketos\u00e4ureausbeute und der Beeinflussung der D-AO-Aktivit\u00e4t bei Umsetzungen mit rac-Phenylalanin unter Verwendung des D-AO-Immobilisats untersucht. (21 Monate).
\nIn den Versuchen mit permeabilisierten und quervernetzten T. variabilis-Zellen zeigte sich, dass das Redoxpotenzial eine m\u00f6gliche Stellgr\u00f6\u00dfe zur Steuerung einer automatischen Katalasezudosage sein k\u00f6nnte. Eine robuste online Redoxelektrode h\u00e4tte gegen\u00fcber dem FIA-System Vorteile hinsichtlich der Schonung von Ressourcen (Enzym, Chromogen, Abwasser) und der wesentlich praktikableren Integration in eine Mess- und Regelanlage. Zu diesem Zweck wurde im letzten Projektabschnitt untersucht, ob diese physikalisch-chemische Elektrode als m\u00f6gliche Stellgr\u00f6\u00dfe f\u00fcr eine automatische Katalasezudosage ver-wendet werden kann (6 Monate).<\/p>\n
Ergebnisse und Diskussion<\/p>\n
In der ersten Projektphase erfolgte ein Screening nach geeigneten Enzymen, die Etablierung photometrischer Assays mit Originalproben des Bioprozesses sowie die Immobilisierung der Enzyme und die Charakterisierung der Immobilisate, um eine FIA zur Detektion von H2O2 aufbauen zu k\u00f6nnen. Dabei stellte sich heraus, dass sich prinzipiell die Peroxidase aus Arthromyces ramosus (Eupergit-Immobilisat) in Kombination mit ABTS [2,2-Azino-bis-3-ethylbenzthiazolin-6-sulfons\u00e4ure] als Chromogen f\u00fcr den Einsatz in eine FIA eignet. Da sich in anschlie\u00dfenden Biotransformationen mit ganzen, permeabilisierten und quervernetzten T. variabilis-Zellen das Redoxpotenzial als m\u00f6gliche Messgr\u00f6\u00dfe zur Steuerung einer automatischen Katalasezudosage aufdr\u00e4ngte, wurde der Einsatz einer FIA vorerst nicht weiter verfolgt. Bei Biotransformationen mit rac-Methionin ohne externe Katalasevorlage unter Verwendung permeabilisierter, quervernetzter Zellen wurde eine a-Ketos\u00e4ureausbeute von 63 % erzielt (Rest-D-AO-Aktivit\u00e4t 20 %). Mit externer Katalasevorlage konnte die a-Ketos\u00e4ureausbeute auf 93 % erh\u00f6ht werden (Rest-D-AO-Aktivit\u00e4t 80 %).
\nBei Einsatz von D-AO-Immobilisat im Umsetzungsprozess lag die Ketos\u00e4ureausbeute ohne Katalasezugabe mit rac-Methionin bei 20% (Rest-D-AO-Aktivit\u00e4t ca. 100 %). Bei externer Zugabe von Katalase aus Rinderleber oder Aspergillus niger und rac-Phenylalanin bzw. rac-Methionin wurden a-Ketos\u00e4ureausbeuten von 70 – 80 % erreicht. Mit der Katalase aus Micrococcus lysodeikticus konnte die Nebenproduktbildung bei Biotransformationen von Phenylalanin vollst\u00e4ndig unterdr\u00fcckt werden (100 % a-Ketos\u00e4ure- und L-Aminos\u00e4ureausbeute, Rest-D-AO-Aktivit\u00e4t ca. 80 %). Bezogen auf die a-Ketos\u00e4urebildung ohne externe Zugabe von Katalase erh\u00f6hte sich die Raum-\/Zeit-Ausbeute von 0,14 g L-1h-1 auf 8,26 g L-1h-1. Da bei Zusatz von Katalase aus Rinderleber und Aspergillus niger kein Aktivit\u00e4tsverlust der D-AO zu beobachten war, bliebe die Ursache der Aktivit\u00e4tsabnahme bei Zusatz von Micrococcus-Katalase noch zu kl\u00e4ren.
\nIm letzten Projektabschnitt wurde untersucht, ob sich das Redoxpotenzial tats\u00e4chlich als Messgr\u00f6\u00dfe zur Steuerung einer automatischen Katalasezudosage eignet. Die Korrelation zwischen gebildeter H2O2-Menge, Katalaseaktivit\u00e4t und Messsignal des Redoxpotenzial-Sensors wurde anhand eines Ganz-Zell-Modells und in Biotransformationen mit D-AO-Immobilisat verifiziert. Es stellte sich aber heraus, dass die Sensitivit\u00e4t des eingesetzten Redoxpotenzial-Sensors im Prozess nicht ausreichte, um eine Katalasezudosage zu garantieren, die eine Nebenproduktbildung effizient unterbinden w\u00fcrde.<\/p>\n
\u00d6ffentlichkeitsarbeit und Pr\u00e4sentation<\/p>\n
M\u00fcller K.M., Gabler M., Fischer L. (1999): Enzymatische Ketos\u00e4ureproduktion beim Einsatz mikrobieller D-Aminos\u00e4ureoxidasen, VAAM-Jahrestagung, G\u00f6ttingen.
\nGabler M., Fischer L. (1999): Bioanalytik Oxidase-katalysierter L-Aminos\u00e4uregewinnung, 17. DECHE-MA-Jahrestagung der Biotechnologen, Wiesbaden.
\nTrost E.M., Bashir I., Fischer L. (2000): Prozessoptimierung der Oxidase-katalysierten L-Aminos\u00e4uregewinnung, 10. Heiligenst\u00e4dter Kolloquium Technische Systeme f\u00fcr Biotechnologie und Umwelt, Heiligenstadt.
\nTrost E.M., Bashir I., Fischer L. (2001): Prozessoptimierung der L-Aminos\u00e4ureproduktion mittels D-Aminos\u00e4ureoxidase, 19. DECHEMA-Jahrestagung der Biotechnologen, Leipzig.
\nTrost E.M., Bashir I., Fischer L. (2001): Minimization of by-product formation during D-amino acid oxidase catalysed production of L-amino acids, BioTrans, Darmstadt.
\nTrost E.M, Borck A., Bashir I., Fischer L. (2001): Prozessoptimierung der Oxidase-katalysierten L-Aminos\u00e4uregewinnung, Biospektrum, Sonderausgabe Sensorik, 15-18.
\nTrost E.M., Fischer L. (2002): Minimization of by-product formation during D-amino acid oxidase catalyzed racemic resolution of D\/L-amino acids, J. of molecular catalysis B: enzymatic, 19-20: 189-195.<\/p>\n
Fazit<\/p>\n
Das Redoxpotenzial erwies sich als Kontrollparameter f\u00fcr eine automatische Katalasezudosage als ungeeignet. Folglich k\u00f6nnte f\u00fcr eine Automatisierung auf den Einsatz einer FIA mit Enzymsensor zur\u00fcckgegriffen werden. Die Voraussetzungen hierf\u00fcr sind in dem Projekt entwickelt worden. Auch ohne einen automatisierten Prozess wurde durch Wahl einer geeigneten Katalase mit D-AO-Immobilisat eine a-Ketos\u00e4ure- und L-Aminos\u00e4ureausbeute von 100 % erzielt. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das verf\u00fcgbare D-AO-Immobilisat gegen\u00fcber den permeabilisierten, quervernetzten Zellen auf Grund seiner h\u00f6heren Prozessstabilit\u00e4t und leichteren Handhabung vorzuziehen ist. Die Integration eines Sen-sors in den in diesem Projekt optimierten Prozess erscheint aus \u00f6konomischer und \u00f6kologischer Sicht nicht mehr zwingend notwendig.<\/p>\n","protected":false},"excerpt":{"rendered":"
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